[发明专利]一种表达IL-21的基因工程乳酸菌的构建方法及其在肿瘤免疫治疗中的应用

说明书

本发明属于微生物基因资源技术领域，公开了一种人IL‑21密码子优化的两段核苷酸序列及其在乳酸菌中的表达体系。特征构建食品级乳酸菌胞内表达质粒载体pNZ8149‑IL21和可溶性表达质粒载体pNZ8149‑sIL21，通过电转至乳酸球菌NZ3900菌株中后，通过食品级诱导剂Nisin诱导得到高表达人IL‑21该基因工程乳酸菌胞内表达菌株NZ3900‑IL21和可溶性表达菌株NZ3900‑sIL21，根据这俩种菌株的生长特点分别扩大生产制备了中试产品NZ3900‑IL21裂解物和NZ3900‑sIL21口服液。肿瘤患者可直接口服本发明的这俩种产品，在缓解肿瘤患者常规治疗引起的肠胃功能毒性同时，还增强机体CD8+T细胞活性、肿瘤微环境M1/M2转化等抗肿瘤免疫功能，对多种肿瘤具有显著的抑制作用，在肿瘤免疫治疗中有重要应用价值。

技术领域

本发明属于微生物基因资源和生物合成技术领域，具体涉及一种pNZ8149-IL21重组质粒的构建，并利用该质粒构建的一株异源胞内表达和可溶性表达人IL-21的乳酸菌基因工程菌株及其在抗肿瘤免疫方面的应用。

背景技术

白细胞介素-21(interleukin-21，IL-21)是近年来发现的一种参与多种免疫细胞的增殖分化和效应过程的细胞因子，包括NK细胞、T细胞、B细胞和DC细胞等，属于I型细胞因子家族，主要是由CD4⁺Th2细胞合成和分泌，其在调节固有性免疫应答和获得性免疫应答中发挥着关键作用。随着肿瘤免疫基因治疗的研究越来越深入，近年来IL-21的抗肿瘤作用也备受关注。研究认为，IL-21可诱导活化Th1细胞，增强机体细胞免疫功能，产生大量IFN-γ，进而促进NK细胞的增殖及CD8+T细胞的CTL效应，达到抑制肿瘤生长的目的。目前IL-21在肿瘤免疫治疗中的效应已得到许多验证，但半衰期很短(仅有2-4小时)和产生抗药抗体等导致IL-21重组蛋白的成药性较差。

乳酸乳球菌(Lactococcus lactis，L.lactis)是胃肠道常见菌之一，参与调节机体胃肠道正常菌群生态平衡，已经成为在发酵、食品和保健品行业中得到广泛运用的模式菌种(model LAB)。因为不具有侵染性和致病性，而且经过修饰的L.lactis能够将外源蛋白有效地递呈给宿主粘膜免疫系统并激发免疫反应，近些年已经成为一种安全、有效、质量可控的细菌疫苗、基因治疗载体等进行广泛的研究。我们前期研究证实，口服L.lactis裂解液与anti-CTLA-4抗体联合治疗可以增强该抗体的抗肿瘤免疫活性，通过抑制小鼠AOM/DSS诱导的结直肠癌肿瘤的发生数量、减少延长动物的生存活率等。是一种良好的免疫增强佐剂效应。

Nisin，即乳酸链球菌素(乳链菌肽)，是一种天然、高效、安全的生物活性抗菌肽，其对包括食品腐败菌和致病菌在内的许多革兰氏阳性菌具有强烈的抑制作用，是目前世界上唯一被允许用作食品添加剂的细菌素。将重组基因导入该系统中制成制剂或疫苗，本发明涉及的基因表达系统中的pNZ8149载体、NZ3900菌株及诱导物Nisin均为食品级，通过该系统将人重组IL-21基因导入NZ3900益生菌中，生物发酵制成活性制剂。该活菌制剂可以直接口服，避免了一般基因工程菌复杂、高成本的后期提取工艺，为用基因工程生产安全廉价的生物制品提供了一种新思路。本发明提供了一种安全无毒的基因治疗的载体，为后期益生菌免疫制剂抗肿瘤的可行性研究提供理论依据与技术支持。

发明内容

鉴于IL-21外源重组蛋白成药性缺点，无法有效利用外源性IL-21重组蛋白的增强免疫功能而达到肿瘤免疫治疗的目的，本发明主要解决的问题是利用在人体内无毒、无害、高效表达的IL-21的基因工程乳酸菌，使人IL-21重组蛋白在肿瘤患者体内持续、高效表达，进而达到肿瘤免疫治疗效果。