[发明专利]检测VKORC1基因rs9923231位点多态性的人工模拟核酸分子信标与试剂盒

说明书

本发明公开了一种VKORC1基因rs9923231位点多态性的分型检测方法与试剂盒。本发明采用VKORC1基因特异性的引物SEQ1和SEQ2扩增VKORC1基因片段，同时在VKORC1基因特异性的引物界定的扩增区域内设计VKORC1基因特异性人工模拟核酸分子信标SEQ3‑FAM和SEQ4‑VIC。本发明提供的基于基因特异性PCR结合人工模拟核酸分子信标判断VKORC1基因rs9923231位点多态性的方法不仅准确率高，而且还具有检测速度快、操作简单、结果判读客观、闭管反应污染少等优点，非常适合于在临床中大规模开展。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及VKORC1基因rs9923231位点多态性的分型检测方法与试剂盒。

背景技术

深静脉血栓形成（DVT）是在深静脉中形成的血凝块，常见于股静脉或腘静脉等大静脉中。常见表现为相关部位的疼痛、肿胀、发热。血凝块可以转移到肺部，形成肺栓塞。DVT形成的因素包括手术、创伤、癌症、肥胖、吸烟、激素分娩控制、抗磷脂综合征和遗传病等。随着年龄的增长，其发病率逐渐增加。

目前，抗凝血（血液稀释剂）治疗DVT是普遍采用的方法。典型的药物包括低分子量的肝素、华法林、香豆素或直接口服抗凝剂。其中，华法林是广泛使用的第一代抗凝血剂，常用于治疗血栓，预防中风。然而患者对华法林的治疗反应却受到不同因素的影响，如年龄、性别、维生素K摄入量和药物剂量。此外，某些基因缺陷的个体会出现治疗反应不良，在临床实践中会导致内出血和中风。全基因组关联研究证实，某些基因与华法林药物代谢相关，它们与环境等其它因素相互作用，共同影响华法林治疗的给药剂量。

维生素K环氧还原酶复合物1（VKORC1）是内质网的一种小跨膜蛋白，在维生素K途径中起主要作用，是华法林的靶蛋白。VKORC1基因非编码突变的存在导致蛋白的差异表达，决定了患者的药物剂量。已发现VKORC1的rs9923231(G/A)是华法林剂量相关的重要标签。A为低剂量高度敏感型，G为高剂量不敏感型。对该位点进行检测是针对不同患者治疗的重要依据。

目前，基因多态性检测的方法主要有PCR-Sanger测序法、芯片杂交法、高分辨率溶解曲线法等。这些方法虽然都可以在一定程度上检测基因多态性，但都有不可忽视的局限性。Sanger测序法步骤较多，需要PCR后处理，不仅操作繁琐，还易产生污染，并不能满足临床的需求。芯片杂交法操作繁琐，其检测还依赖于昂贵的设备仪器，导致成本较高。高分辨率溶解曲线法对仪器要求高，需要具有安装高分辨率软件、温度比较敏感的机器才能使用，临床推广存在困难。基于Taqman水解探针的荧光定量PCR，利用Taq酶的外切酶活性，切断探针产生荧光信号，由于Taqman探针荧光基团与淬灭基团并不紧密靠近，导致荧光淬灭不彻底，存在背景荧光信号。此外，Taqman探针对于单碱基错配识别能力较差，极易生成 非特异荧光信号，干扰结果判读，进而影响检测的准确性。因此，临床上迫切需要一种简便易行、灵敏度高、准确可靠的检测基因多态性的方法。