[发明专利]一种蛋白质氨基酸序列覆盖度的检测方法

权利要求书

1.一种蛋白质氨基酸序列覆盖度的检测方法，该检测方法包括蛋白还原烷基化、蛋白酶解、多肽脱盐、液质检测和数据分析，其特征在于：

所述蛋白酶解是通过加入弹性蛋白酶进行单酶切获得肽段，其中，弹性蛋白酶与待检测的蛋白质的质量比为1：（20~100）。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述多肽脱盐是对蛋白酶解后的肽段进行脱盐处理，具体为：

首先向肽段中加入三氟乙酸，进行上样，缓慢过HLB柱一次，保证样品和柱子充分结合；然后加入三氟乙酸清洗柱子，重复2次；最后用三氟乙酸、水和乙腈的混合液洗脱结合在HLB柱子上的肽段，重复1次，合并洗脱液。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，加入弹性蛋白酶进行单酶切获得肽段的具体步骤为：

还原烷基化后的蛋白质样品离心后加入弹性蛋白酶液，恒温37℃、500rpm混匀酶切15min~2h。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述弹性蛋白酶液制备方法为：称取1mg的弹性蛋白酶，在0.5mL双蒸水中重悬，BCA定量蛋白浓度后，稀释至最终浓度为1mg/mL。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述蛋白还原烷基化的方法包括丙酮沉淀法和稀释法；所述丙酮沉淀法适用于含有去污剂的待测蛋白质样品；所述稀释法适用于不含有去污剂的待测蛋白质样品；所述去污剂包括NP40和吐温80。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述丙酮沉淀法对待检测的蛋白质还原烷基化的具体步骤为：

称取待测蛋白质样品，加入十二烷基硫酸钠混匀，然后加入三乙基碳酸氢铵调至pH至为8；向混合物溶液的底部加入三(2-羧乙基)膦，瞬时离心后恒温还原反应；待还原反应结束后，加入碘乙酰胺恒温烷基化反应，待烷基化反应结束后，加入丙酮沉淀蛋白质；离心洗涤后加入三乙基碳酸氢铵充分溶解蛋白质沉淀。

7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述稀释法对待检测的蛋白质还原烷基化的具体步骤为：

称取待测蛋白质样品，加入尿素混匀，然后加入三乙基碳酸氢铵调至pH至为8；向混合物溶液的底部加入三(2-羧乙基)膦，瞬时离心后恒温还原反应；待还原反应结束后，加入碘乙酰胺恒温烷基化反应，待烷基化反应结束后，加入三乙基碳酸氢铵稀释反应产物。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，进行所述液质检测时，采用的液相色谱-质谱中，液相色谱的检测参数如下：

使用C18柱，单柱模式；A相为0.1%FA水，B相为0.1%FA乙腈；纳升液相流速为0.3微升/分钟，线性梯度为2~20%B，30分钟；20~40%B，10分钟；40~80%B，2分钟；80%B，5分钟；80~2%B，1分钟；2%B，20分钟；常规液相流速为200微升/分钟，线性梯度为2~20%B，30分钟；20~40%B，10分钟；40~80%B，2分钟；80%B,5分钟；80~2%B，1分钟；2%B，20分钟。

9.根据权利要求1或8所述的检测方法，其特征在于：进行所述液质检测时，采用的液相色谱-质谱中，质谱的检测参数如下：

一级扫描范围200~2000，分辨率大于30000，二级的扫描范围100~2000或4000，分辨率大于15000；DDA模式，TOP10或者TOP20，电荷1~6或者2~6，离子检测一次后排除10~15S。

10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述数据分析是采用的蛋白搜库软件对液质检测的数据进行分析从而判断待测蛋白质氨基酸序列的覆盖度，其中，所述蛋白搜库软件包括Proteome Discoverer和/或PEAKS。

11.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于，所述数据分析的检测设定为：一级允许误差10~20ppm；二级允许误差0.02~0.1Da；设置酶切位点为非特异；长度5~50氨基酸；可变修饰包括蛋白N端乙酰化和M氧化；固定修饰包括C烷基化；离子为b和y离子。