[发明专利]一种免疫组库测序文库的构建方法及试剂盒

说明书

一种免疫组库测序文库的构建方法及试剂盒本发明属于生物医药领域，涉及一种免疫组库多样性的检测方法。本发明的目的之一提供一种免疫组库测序文库构建的方法，（a）提取样本RNA，（b）使用逆转录引物逆转录合成cDNA，并在末端添加含有分子标签序列的特异性接头，（c）以b步产物为模板，通过特异性接头引物与含有分子标签序列的基因特异性引物进行扩增，（d）最后在扩增产物上添加测序文库接头，完成文库构建。在分析测序数据时，通过分子标签序列识别原始RNA分子，排除扩增偏倚。使用该方法可以覆盖TCR和BCR的全部CDR区域，并且有效排除PCR扩增偏倚干扰，特异性更强，分析结果更准确。本发明的目的之二是提供一个免疫组库测序的试剂盒。

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种免疫组库多样性的检测方法。

背景技术

免疫组库是指在任何指定时间，某个个体的循环系统中所有功能多样性B细胞和T细胞的总和。免疫组库测序是以 T/B 淋巴细胞为研究目标，扩增决定B细胞受体（BCR）或T细胞受体（TCR）多样性的互补决定区（CDR区），结合高通量测序技术，全面评估免疫系统的多样性。

免疫组测序可以观察和分析T细胞和B细胞，达到前所未有的深度和特异性。在疾病监控，抗体生产，疫苗研究，健康体检等领域有广泛的应用。

目前免疫组库测序广泛使用的文库构建方法主要有多重引物扩增法、半巢式扩增法、5’ RACE扩增法、SMART扩增法。

多重引物扩增法主要扩增TCR或BCR 的CDR3区，并且容易出现扩增偏倚，特异性较差，导致检测结果不准确。

5’ RACE扩增法使用末端转移酶技术，在逆转录完成后，经过末端添加C、结合ployG引物并合成第二链，在cDNA末端添加特异性接头，可以使用一对引物扩增TCR或BCR的全部互补决定区，但仍不能完全避免PCR偏倚和特异性差的缺点，虽然也有使用一条内侧引物和特异性接头进行扩增，但也仅解决了特异性差的缺点，无法完全消除PCR扩增偏倚。

SMART扩增原理与5’RACE扩增法类似，不同处在于，SMART使用逆转录酶的模板转换特性在cDNA末端添加特异性接头进行扩增。其缺点与5’ RACE相同，但是实现了逆转录反应和添加特异性接头一步完成。

因此，寻找一种可以覆盖全部CDR区，有效排除PCR偏倚干扰，特异性强的文库构建方法尤为重要。

发明内容

为了克服以上技术的缺点，本发明的目的之一提供一种免疫组库测序文库构建的方法，使用该方法可以覆盖TCR和BCR的全部CDR区域，并且有效排除PCR扩增偏倚干扰，特异性更强，分析结果更准确。

本发明的目的之二是提供一个免疫组库测序的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种免疫组库测序文库构建的方法。

在一个方面，所述的方法包括：（a）提取样本RNA，（b）使用逆转录引物逆转录合成cDNA，并在末端添加含有分子标签序列的特异性接头，（c）以b步产物为模板，通过特异性接头引物与含有分子标签序列的基因特异性引物进行扩增，（d）最后在扩增产物上添加测序文库接头，完成文库构建。在分析测序数据时，通过分子标签序列识别原始RNA分子，排除扩增偏倚。

在进一步的一个方面，所述的样本不限物种，可以为人源样本，也可以为鼠源。

在进一步的另一个方面，所述的逆转录引物可以为oligodT，也可以为基因特异性引物。

在进一步的另一个方面，所述的分子标签序列为（N）_X，N=A或T或C或G，X大于等于2，优选的X=10。

在进一步的另一个方面，所述的含有分子标签序列的特异性接头是在3’端含有polyGr的单链序列。