[发明专利]用于核酸扩增的方法、组合物、系统、仪器和试剂盒

权利要求书

1.一种引物延伸的方法，所述方法包括：

a)使第一引物分子(“第一正向引物”)与核酸链(“反向链”)上的互补的引物结合序列(“反向链PBS”)杂交；其中所述第一正向引物的至少60％的核苷酸碱基是腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶，或者与腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶互补；

b)通过使用所述反向链作为模板延伸所述第一正向引物分子，产生延伸的第一正向链，所述延伸的第一正向链是所述反向链的全长互补物且与所述反向链杂交；和

c)使第二引物分子(“第二正向引物”)与所述反向链PBS杂交，其中所述反向链也与所述第一正向链杂交。

2.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括：通过一个或多个包括步骤(b)和(c)的扩增循环来扩增所述正向链，其中第一个扩增循环的步骤(c)的第二正向引物是后续扩增循环的步骤(b)的第一正向引物；且其中大部分的反向链在所述一次或多次重复过程中或之间的所有时间与正向链杂交。

3.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述大部分的反向链是至少30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的反向链。

4.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，所述方法包括，如下扩增所述反向链：

a)使第一反向引物分子与延伸的正向链上的互补的反向-引物结合序列(“正向链PBS”)杂交；

b)通过使用所述正向链作为模板以模板依赖性的方式延伸所述第一反向引物分子，产生延伸的第一反向链，所述延伸的第一反向链是所述正向链的全长互补物且与所述正向链杂交；和

c)使第二引物(“第二反向引物”)与所述正向链PBS杂交，其中所述正向链也与所述第一反向链杂交。

5.根据权利要求4所述的方法，所述方法包括：通过步骤(b)至(c)的一次或多次重复来扩增所述反向链，其中步骤(c)的第二反向引物是重复的步骤(b)的第一反向引物；且其中大部分的正向链在所述一次或多次重复过程中或之间的所有时间与反向链杂交。

6.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述大部分的反向链是至少30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的反向链。

7.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述第一正向引物和/或第二正向引物被固定化至单一载体，或者所述第一反向引物和/或第二反向引物被固定化至单一载体。

8.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，所述方法另外包括：在执行期望数目的扩增循环以后，使所述延伸的正向链与反向链完全分离，并且任选地，从存在的分离的反向链中除去分离的正向链，或反之亦然。

9.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中在一个或多个扩增循环过程中，所有核酸试剂在任何时间未与重组酶或逆转录酶或解螺旋酶或切口酶或非聚合酶的任意其它酶接触。

10.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中使用反向链作为模板对正向引物的模板依赖性延伸导致已经与所述反向链杂交的另一个正向链的置换。