[发明专利]流式抗体及其制备方法和滴定方法

说明书

本发明涉及一种流式抗体及其制备方法和滴定方法，该流式抗体的制备方法包括如下步骤：采用反应缓冲液制备APC溶液；向APC溶液中加入ASE进行封闭反应，得第一中间体；向含第一中间体的反应缓冲液中加入SMCC进行活化反应，得第二中间体；将DTT与IgG或IgM进行还原反应，得还原IgG或还原IgM；将含还原IgG或还原IgM的反应缓冲液与含第二中间体的反应缓冲液混合，过夜反应，加入NEM，反应，即得。该流式抗体的制备方法操作简便，可重复使用，且制成的流式抗体染色指数显著提升，明显减少背景结合，显著提升目标细胞的荧光亮度。

技术领域

本发明涉及一种流式抗体及其制备方法和滴定方法。

背景技术

抗体与蛋白偶联工艺，是通过对抗体或目的蛋白进行活化，使它们通过共价键偶联成一个具有生物靶向性的复合物。该偶联工艺在基于抗体的免疫学检测方法中发挥着重要作用，如流式抗体、免疫荧光抗体、免疫组化抗体、Western Blot的酶标二抗等等以及抗体偶联药物。借着抗体，尤其是单克隆抗体，功能蛋白被赋予特异性识别靶分子的能力，使得功能蛋白的实用性大大提高。

抗体与蛋白染料的偶联本质上是蛋白质与蛋白质之间的偶联。蛋白质分子中可用于偶联反应的活性基团通常有氨基、羧基和巯基。蛋白质分子之间的偶联通常通过一些活性化学小分子与两个蛋白分子的活性基团分别连接而实现。抗体重链之间通常含有丰富的、暴露在水溶液中的二硫链，容易被DTT、TECP、2-ME等试剂还原为巯基，因而常常被用作抗体修饰的活性靶点。这样，与抗体偶联的蛋白分子上只需引入与巯基反应的活性基团，如马来酰亚胺(NEM)等，即可实现蛋白分子与部分还原后的抗体之间的偶联。

蛋白质分子作为生物大分子通常含有多个活性反应基团。当蛋白分子之间偶联时，常常会发生蛋白分子之间交联，形成沉淀。对于流式抗体修饰而言，二硫键被还原后，会在一个抗体分子上至少形成两个巯基。与之偶联的蛋白染料，通常通过氨基修饰引入与巯基反应的活性基团，即也会在蛋白染料表面形成多个活化位点。当两者偶联之时，很容易形成多个分子交联的庞大分子，最终在流式抗体应用中表现为：细胞的荧光信号分布变宽，并且在阳性细胞群之外形成多个杂峰，严重扭曲目标蛋白表达水平的分布情况。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供一种能够改善目标蛋白表达水平的分布情况的流式抗体及其制备方法和滴定方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种流式抗体的制备方法，包括如下步骤：

采用反应缓冲液制备别藻青蛋白(APC)溶液；

向所述APC溶液中加入乙酰基琥珀酰亚胺酯(ASE)，于37±1℃条件下进行封闭反应，得第一中间体；

向含所述第一中间体的反应缓冲液中加入琥珀酰亚胺4-(N-马来亚酰胺甲基)-环己胺-1-羧酸(SMCC)，于37±1℃条件下进行活化反应，得第二中间体；

将二硫苏糖醇(DTT)与IgG或IgM于37±1℃条件下进行还原反应，得还原IgG或还原IgM；

将含还原IgG或或还原IgM的反应缓冲液与含所述第二中间体的反应缓冲液混合，于4℃条件下，过夜反应，得第三中间体；

向含所述第三中间体的反应缓冲液中加入NEM，于37±1℃条件下反应，即得。

在其中一个实施例中，所述IgG或所述IgM与所述APC的质量比例为19-21:22-25。

在其中一个实施例中，所述流式抗体的制备方法还包括剔除未反应的ASE、剔除未反应的SMCC、剔除未反应的DTT、剔除未反应的NEM的步骤。

在其中一个实施例中，剔除未反应的试剂的步骤为：将反应后的相应溶液稀释，转移至50kDa超滤管中，于11000-13000rpm转速下离心2-10min。