[发明专利]一种茄子果实基因沉默体系及其构建方法

说明书

本发明公开了一种茄子果实基因沉默体系及其构建方法，具体公开了茄子花青素合成代谢相关基因SmANS和SmMYB1基因CDS序列在构建茄子果实VIGS体系中的应用，CDS序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明建立了一种高效快速的茄子果实病毒介导的基因沉默系统，可以用于茄子果皮色素代谢、果皮光泽和单性结实等果实重要性状调控基因功能验证分析。明确了环境温度、注射用果实大小、目的基因插入片段大小以及注射量对茄子果实VIGS体系的影响。本发明的基因沉默体系简便、快速、高效，可以应用到茄子果实发育及其它含花青素组织基因功能验证。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种茄子果实基因沉默体系及其构建方法。

背景技术

病毒介导的基因沉默Virus Induced Gene Silence(VIGS)是用来揭示RNA介导的抗病毒防御机制，是一种转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)现象，是植物体内固有的、普遍存在的遗传免疫机制。未加修饰的病毒侵染植物时，其机制是特异性的以病毒基因组为防御目标；但当寄主基因片段插入病毒载体时，其攻击目标增加了植物寄主基因片段相对应的mRNA。VIGS作为一种反向遗传学技术，近20年来广泛的应用于植物发育、生物逆境、非生物逆境、细胞代谢、信号传导等基因功能的研究。

茄子是以果实为商品的蔬菜作物，其果实发育过程中许多重要的功能基因决定着重要的农艺性状，如果皮花青素代谢途径上的基因决定着果皮颜色，单性结实性状相关基因决定着不良环境条件下茄子的坐果率等。

从已有报道来看，茄子上有关病毒介导的基因沉默基本上是以子叶(Liu HP,FDQ,Zhu BZ,et al.Virus-induced gene siliencing in eggplant(Solanum melongenaL.).Journal of Integrative Plant Biology,2012,54(6):422-429；赵祯，刘富中，张映等.茄子Sm MsrA基因VIGS表达载体的构建及表达分析.园艺学报，2015，42(8)：1495-1504)为受体，直接以茄子果实为VIGS受体组织尚未见相关报道。Fu等(Fu DQ,Zhu BZ,Zhu HL,etal.Virus-induced gene siliencing in tomato fruit.Plant journal,2005,43(2):299-308)利用改良的TRV载体研究发现与茄子同属茄科的番茄果实生物素合成或乙烯信号转导途径相关基因的沉默造成了果实颜色与细胞壁结构的改变，并且发现果实表现型的改变是由目的基因转录水平的减少所致。因此，开展茄子果实病毒介导的基因沉默研究，可以为茄子果实发育相关的重要性状基因功能验证提供快速有效的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种茄子果实基因沉默体系及其构建方法。

本发明利用自有的茄子转录组序列信息，从茄子果皮中扩增花青素合酶SmANS基因和转录因子SmMYB1的编码区。通过酶切连接重组技术，各构建了2个含SmANS和SmMYB1基因不同片段的烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导的基因沉默(VIGS)表达载体。表达载体转入农杆菌GV3101后，用注射压迫法侵染茄子幼果。采用表型观察、和qPCR技术，评价构建的VIGS体系对SmANS和SmMYB1基因的沉默效果。

本发明所采取的技术方案是：

茄子花青素合成代谢相关基因SmANS和SmMYB1基因CDS序列在构建茄子果实VIGS体系中的应用，CDS序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，其中

SEQ ID NO.1：