[发明专利]一种用于检测犬、猫、貂细小病毒的通用的RPA引物、RPA探针、试剂盒及核酸检测方法

说明书

本发明公开一种用于检测犬、猫、貂细小病毒的通用的RPA引物、RPA探针、试剂盒及核酸检测方法，其中RPA引物包括正向引物为PVRPAF，其序列为：CCATCTCATACTGGAACTAGTGGCACACCAAC，反向引物为PVRPAB，其序列为：Bio‑CTCAAAA GAATAATATGGTGCACTATAACCAAC，基于RPA引物扩增区域设计的RPA探针为PVRPAP，其序列为：FAM‑CTCCTTCAGCTTGAGGCAAAGAATTTAGAAATGGTGGHAAGCCCAATGCTC‑C3s pacer。本发明将样品简易处理、重组酶扩增技术和侧流层析技术相结合，在发病现场不需要任何设备就可进行检测，1小时内可得到检测结果，能第一时间采取措施进行治疗处理，非常适于现场使用。

技术领域

本发明属于病毒检测生物技术领域，具体涉及一种用于检测犬、猫、貂细小病毒的通用的RPA引物、RPA探针、试剂盒及核酸检测方法。

背景技术

犬、猫、貂细小病毒可分别引起相应宿主发生严重的病毒性腹泻，具有很高的致死性和传染性。

猫细小病毒(FPV)引起的猫泛白细胞减少症以高热、呕吐、白细胞严重减少和肠炎为特征。在自然条件下感染猫科和鼬科多种动物，如虎、豹、狮子和浣熊，但以体型较小的猫科动物，包括水貂最为易感。FPV是目前本属病毒中感染范围最宽，致病性最强的一种。因此也是本属中的主要病毒之一。猫泛白细胞减少症是一种主要侵害幼猫的高度接触性传染病，潜伏期2～9天，平均4天。本病的临床表现甚为多样，分为特急性型、急性型、亚急性型和不显型。特急性型不待发现临床症状即突然死亡，畜主往往怀疑为中毒，急性型可于24小时内死亡，亚急性型可持续数日到一周，呈双相热，第一期发热时病畜体温升高40℃左右，持续约一天，发热平息后数天第二次发热，体温40℃以上，同时出现厌食、呕吐、沉郁、出血性肠炎和脱水等症状，病猫多于5～6天死亡，死亡率一般为60％～70％。

犬细小病毒(Canine Parvovirus，CPV)主要感染犬，其他犬科动物，如郊狼、丛林犬、食蟹狐和鬣狗等也可以感染。随着病毒抗原漂移，病毒已经可以感染猫、小熊、貉等动物。该病潜伏期3-5天，多数呈现肠炎综合症，少数呈现心肌炎综合症。肠炎病犬初期精神沉郁，厌食，偶见发热，软便或轻微呕吐，随后发展成为频繁呕吐和剧烈腹泻。起初粪便呈灰色，黄色或乳白色，带果冻状粘液，其后排出恶臭的酱油样或番茄汁样血便。病犬迅速脱水，消瘦，眼窝深陷，被毛凌乱，皮肤无弹性，耳鼻，四肢发凉，精神高度沉郁，休克，死亡。从病初症状轻微到严重一般不超过2天，整个病程一般不超过一周。

貂细小病毒引起水貂病毒性肠炎，以出血和坏死急剧下痢，白细胞高度减少为特征。胃肠症状明显，呕吐黄绿色水样或粥样物，腹泻，排出稀软到水样或脓样粪便，继之便中带血、粘膜脱落物和未消化饲料、粘液及大量气泡，有的混有血丝或血凝块。幼龄水貂有较高的发病率和死亡率，多数病貂转归死亡，造成巨大损失。这是世界公认的危害水貂养业较严重的传染病之一。水貂，不同品种、年龄、性别的水貂都易感，以幼貂，特别是刚断乳的仔貂最易感，发病率和死亡率都较成年水貂高。MEV虽能使猫、犬、貉发病。

这些疾病在病毒血症期间，病畜的粪、尿和各种分泌液均含有病毒。本病毒对外界环境有较强的抵抗力，被污染的食物、器具和衣服等均可引起疾病传播，以经口为主，也能经飞沫传染。因此，进行病原的早期检测以及环境中病原的检测，对于预防或治疗该病具有重要的意义。然而，当前对这三种病原的检测需借助实验室检测方法，需要昂贵的实验室条件、仪器设备和专业技术，并且需要较长的时间，难以满足现场或田间条件下的检测需要。

RPA技术近年新出现的很有临床应用潜力的等温核酸检测技术。RPA技术依赖重组酶、单链结合蛋白和链置换聚合酶的共同作用在常温下就可以进行核酸的扩增，可以在非常短的时间内使目的基因以指数级增长，配合标记探针和侧流层析技术便可实现对扩增产物的现场实时监测，不需任何专业的仪器设备，并且简便快速，非常适于现场或田间使用，可以在家庭、宠物门诊或养殖场内进行病原的检测，对于疾病的诊断和防控具有重大的临床应用价值，具有广阔的应用前景。