[发明专利]一种鉴别四种镰刀菌的方法

说明书

本发明提供了一种鉴别四种镰刀菌的方法，属于高分辨熔解曲线分析技术领域。本发明方法采用1对特异性引物，基于实时荧光PCR(RT‑PCR)熔解曲线鉴别层生镰刀菌，尖孢镰刀菌，半裸镰刀菌，腐皮镰刀菌，所述1对特异性引物的序列如SEQ ID NO.1‑2所示。本发明灵敏度高、特异性好，检测速度快，可用于临床诊断、农业生产、食品安全等方面镰刀菌种的鉴别，从而为镰刀菌的感染治疗、农业生产和食品安全的监测提供确实可靠的依据。

技术领域

本发明涉及多种真菌检测技术领域，具体地说涉及一种鉴别四种镰刀菌的方法，所述四种镰刀菌为层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)，尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum Schl.)，半裸镰刀菌(Fusarium semitectum)，腐皮镰刀菌(Fusarium solani)。

背景技术

镰刀菌属于有丝分裂孢子真菌，广泛存在于土壤中和植物上，属于条件致病菌。镰刀菌属中有许多危害经济植物的种，它们是植物维管束系统的寄生菌，在适宜的环境条件下，不但破坏作物的输导组织维管束，而且在菌体生长发育代谢过程中产生毒素危害作物，造成作物萎蔫、穗腐、腐烂、死亡，影响产量和品质，严重时可导致产量显著下降。致病性尖孢镰刀菌侵染植物引起植物枯萎病，导致维管束病害，造成植株枯死，其在植株的全生育期均可发生，对生产造成巨大损失。腐皮镰刀菌可引起多种经济作物根腐病，还可引起一些植物的果实腐烂，如甜辣椒果腐病。半裸镰刀菌侵染双孢蘑菇子实体后，一般表现为生长发育受阻、生长无力，子实体颜色淡黄，严重者变成长大的僵菇或萎缩菇。

镰刀菌产生的毒素种类繁多，其中主要是玉米赤霉烯酮、单端孢霉毒素、串珠镰刀菌素和伏马菌素等，对人体和家畜都具有巨大危害。层生镰刀菌可引起角膜炎、眼内炎、甲真菌病(甲癣)、浅表性化脓性血栓性静脉炎，免疫力低下患者可致严重的系统感染甚至危及生命。研究显示，我国中原地区真菌性角膜炎感染镰刀菌以腐皮镰刀菌复合体最多，尖孢镰刀菌复合体居第三位。人进食被镰刀菌侵染的麦子或玉米后半小时至一小时可出现中毒症状，即醉谷病。拟枝孢镰刀菌等侵染谷物后，产生的毒素可侵害人造血系统和其他器官，致使白血细胞和血小板大量减少，导致中毒性白细胞缺乏症；其侵染牛毛草也可使牛食后出现失重、驼背、烂蹄、牛尾坏死等症状。镰刀菌毒素难以分解、毒素活性检测困难、有效的脱毒过程较为复杂，故对食品和农作物真菌污染的早期鉴定显得尤为重要。

真菌核糖体基因转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)，又叫内转录间隔区，是位于真菌核糖体DNA(rDNA)上18S和28S基因之间的区域片段。rDNA在种内由于基因的流动而经常表现出很高的同源性，在种间则保持着各种程度的变异。变异的多少能够反映生物进化上属内种间亲缘关系的远近。ITS1和ITS2作为非编码区，承受的进化选择压力较小，其保守性基本上表现为种内相对一致，种间差异比较明显。这种特点使ITS适合于真菌物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析。

传统的镰刀菌分类鉴定方法主要依靠其形态特征，比较费时，常常需要2～3周才能得到最终结果。有时培养物不典型或不产孢，使得鉴定困难。除形态学培养鉴定外，常用通用引物ITS1、ITS4对rDNA ITS基因PCR扩增后测序，将测序结果在NCBI进行基本局部比对，根据比对结果判断菌种，但有时该方法难以对所有真菌菌株进行准确鉴定，存在无法扩增的现象。此外，还常用PCR-RFLP鉴定镰刀菌种，即比较不同镰刀菌rDNA ITS序列的限制型内切酶位点，设计特异性引物进行PCR扩增，在PCR扩增后用该限制酶切割PCR产物，所得扩增片段具有高度多态性，这些不同长度的等位片段可用PAGE分离，从而区分不同菌种。上述方法虽然普遍应用，但耗时较长，可能延误治疗，使患者病情加重，或者无法及时鉴定病原影响食品安全监测的时效性。

发明内容