[发明专利]一种磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法及其应用

权利要求书

1.一种磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法，其特征在于，所述方法包括将含有外源基因的质粒与具有顺磁性、表面覆盖一层PEI薄膜的Fe₃O₄的磁性纳米载体连接，得到基因—磁性纳米载体复合物；在花粉液体培养基中混合基因—磁性纳米载体复合物与待转化植物花粉，在0.1～0.5T的磁场介导下进行磁转化，直接递送基因—磁性纳米载体复合物进入花粉孔；然后通过植物授粉和受精过程实现待转化植物的外源基因遗传转化；

质粒与磁性纳米载体质量比为1：l；

所述花粉液体培养基配方如下：每100mL花粉液体培养基组成为15g蔗糖、10mgH₃BO₃、5.3mgKNO₃，10.3mgCa(NO₃)₂，51.7mgMnSO₄，10.3mg MgSO₄·7H₂O和3mgGA₃，用蒸馏水定容；

磁转化时间为30min；

待转化植物为不结球白菜。

2.根据权利要求1所述的磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法，其特征在于，具体操作步骤包括：

1)提取含有外源目的基因的质粒，将浓度浓缩为100～1000ng/ul；

2)待转化植物人工授粉前一天去雄，细管套住柱头生殖隔离，防止其他花粉污染；

3)将步骤1)提取的质粒与磁性纳米载体按质量比1：l混合，室温连接30min，得到基因—磁性纳米载体复合物；

4)转化当天收集花粉，将培养皿放置于开放但未散粉的花朵下，轻拍花朵使其花粉散落在培养皿孔中，每个孔取0.1～0.2克花粉，立即加入300～500ul的花粉液体培养基，使花粉悬浮在花粉液体培养基中；

5)将步骤3)中连接好的基因—磁性纳米载体复合物加入带有花粉的培养基中，使基因—磁性纳米载体复合物与花粉数量比值为10ul:1g，置于0.1～0.5T的磁场下转化30min，使基因—磁性纳米载体复合物进入花粉孔；

6)使用移液枪吸走培养皿上层的液体，将下层花粉放置到滤纸上吸干水分，然后将花粉在30～35℃，10～15min内晾干；

7)田间授粉，将步骤2)中去雄并进行生殖隔离的细管去掉，将步骤6)中得到的花粉用毛笔蘸取涂抹与柱头上，再用细管重新套住柱头，并做好标记；

8)将步骤7)授粉后的植株培养至自然成熟后收获种子，播种后待长出第二片真叶后，取第二片真叶的叶片组织在荧光显微镜下，根据外源目的基因荧光特性选择适合的紫外线激发波长激发后，能够观察到相应荧光的即为候选阳性植株；在候选阳性植株长出第四片真叶和第八片真叶时，分别在荧光显微镜下，根据外源目的基因荧光特性选择适合的紫外线激发波长激发后，对叶片组织进行两次筛选，均能够观察到相应荧光的即为转化了基因—磁性纳米载体复合物的T₀代阳性植株；

9)摘取T₀代阳性植株叶片，提取基因组DNA，利用目的基因引物进行PCR检测，经测序筛选出包括目的基因的T₀代阳性植株。

3.根据权利要求1或2所述的磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法，其特征在于，所述磁性纳米载体粒径为100nm。

4.根据权利要求1或2所述的磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法，其特征在于，所述待转化植物花粉选自尚未散粉的花苞；授粉的待转化植物在人工授粉前一天去雄，并保证柱头生殖隔离且完整健康。

5.根据权利要求4所述的磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法，其特征在于，收集花粉时间为天气晴朗条件下，早晨九点时收集。