[发明专利]人羊膜上皮细胞外泌体在制备修复卵巢功能药物中的应用

说明书

本发明提供了人羊膜上皮细胞外泌体在制备修复卵巢功能药物中的应用。动物实验证实，人羊膜上皮细胞外泌体能显著增加化疗损伤卵巢卵泡数量，抑制化疗药物诱导的卵巢急性血管损伤及颗粒细胞凋亡，部分抑制化疗药物诱导的原始卵泡激活，因此可用于修复化疗损伤后的卵巢功能、减轻化疗药物对卵巢的损伤、防治化疗药物引起的卵巢早衰或防治化疗引起的不孕不育。本发明还提供了一种人羊膜上皮细胞外泌体的制备方法，其对化疗损伤卵巢表现出非常显著的修复作用。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，涉及人羊膜上皮细胞外泌体在制备修复卵巢功能药物中的应用。

背景技术

人羊膜属于胎儿附属物，是胎盘发育的早期产物，主要由上皮层、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层组成。人羊膜上皮细胞(human Amniotic Epithelial Cells，hAECs)来源于上皮层，是由胚泡内细胞团发育而来。近年来研究表明，hAECs具有部分胚胎干细胞特性，在特定条件下，可向3个胚层不同类型的细胞分化。而且，hAECs具有免疫耐受、低免疫原性和非致瘤性等优良特点，并兼有旁分泌功能，可分泌多种生长因子、神经营养因子和抗炎因子。因此，hAECs是干细胞治疗和再生医学领域的理想种子细胞资源。目前在hAECs治疗神经系统疾病、心脏疾病、肝脏疾病、肺脏疾病、卵巢早衰以及修复皮肤缺损和抗肿瘤方面均有研究。

外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。外泌体的提取主要包括以下几种方式：超速离心法、过滤离心法、密度梯度离心法、免疫磁珠法、PS亲和法和色谱法。人体内多种细胞及体液均可分泌外泌体，包括内皮细胞、免疫细胞、血小板、平滑肌细胞等。外泌体可通过其携带的蛋白质、核酸、脂类等来调节受体细胞的生物学活性。

期刊《中国细胞生物学学报》2018年第08期刊出的论文“人羊膜上皮干细胞来源的外泌体促进小鼠神经干细胞向神经元方向分化”，公开了首次发现hAECs能促进小鼠NSCs向神经元方向分化。具体地，首先采用超速离心的方法得到了纯度较高的hAECs-Exos，然后将不同浓度的hAECs-Exos与mNSCs共培养。结果发现，与没有hAECs-Exos的对照组相比，200ng/mL hAECs-Exos能明显促进小鼠NSCs向成熟神经元分化，主要表现在NeuN阳性细胞所占比例明显增高。研究者推测，hAECs-Exos保留了hAECs的一些特性，其含有的神经营养因子、生长因子、miRNAs等活性物质可能参与了微环境的调控，从而促进mNSCs向神经元方向分化。因此，hAECs-Exos可能促进内源或外源NSCs的神经分化，从而促进损伤或退化神经元的再生。

然而，目前还未见人羊膜上皮细胞外泌体用于修复卵巢功能的报道。

发明内容

本发明针对现有技术中的不足，第一方面提供了人羊膜上皮细胞外泌体在制备修复卵巢功能药物中的应用。

作为一个优选例，所述的修复卵巢功能指修复化疗损伤后的卵巢功能、减轻化疗药物对卵巢的损伤、防治化疗药物引起的卵巢早衰或防治化疗引起的不孕不育。

作为另一优选例，所述的人羊膜上皮细胞外泌体制备方法为：

(1)将足月健康产妇新鲜的羊膜组织经0.25％胰酶消化10-15min分离出人羊膜上皮细胞，重悬于含有胎牛血清的DMEM/F12培养基中，接种于细胞培养皿中后置于含有5％CO₂的37℃细胞培养箱中进行培养；当细胞融合度达到70％-80％时，使用0.25％胰酶消化贴壁细胞2-3min并重悬于含有胎牛血清的DMEM/F12培养基中，重新调整细胞密度并接种于细胞培养皿中，放置于含有5％CO₂的37℃细胞培养箱中进行培养；待细胞密度再次达到70％-80％时，吸出含血清的完全培养基，用PBS缓慢洗涤2-3次后更换无血清的DMEM/F12培养基培养；20小时后，缓慢地将培养基吸出，在1500-2500g条件下离心20-40min收集上清，并使用孔径0.2μm的滤器将获得的培养基再次过滤去除残余细胞碎片，得到条件性培养基；