[发明专利]一种荧光可视化快速检测猪繁殖与呼吸综合征美洲型毒株的RT-LAMP试剂盒

说明书

本发明公开了一种荧光可视化快速检测猪繁殖与呼吸综合征美洲型毒株的RT‑LAMP试剂盒。本发明的试剂盒中包含了针对猪繁殖与呼吸综合征美洲型毒株设计的引物组合，所述引物组合中包含了一对外引物、一对内引物和一条环引物。利用本发明制备的RT‑LAMP试剂盒可实现对猪繁殖与呼吸综合征美洲型毒株的高灵敏度和高特异性检测，检测最低为10copies，同时操作简便，成本较低，适于在疫情预爆发时现场快速诊断疫病，及时控制疫情。

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及猪繁殖与呼吸综合征美洲型毒株的RT-LAMP试剂盒。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)引起的一种以怀孕母猪繁殖障碍、尤其哺乳仔猪呼吸困难为特征的高度接触性传染病。该病在1987年首次暴发于美国，随后在加拿大、欧洲与亚洲相继出现，目前已经在世界范围内流行，每年造成巨大的经济损失。我国在1995年首次出现PRRS，随后迅速蔓延。2006年在我国全面暴发了以体温高、发病率高、死亡率高为主要临床特征的猪“高热病”，而导致该病的病原是较之前在国内流行的经典美洲型PRRSV发生变异的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(highly pathogenic PRRS，HP-PRRS)。根据病毒基因组及血清型特性，可将PRRSV划分为两种基因型，即以LV株为代表的基因1型(欧洲型)和以VR2332株为代表的基因2型(美洲型)。我国国内主要流行的为基因2型(美洲型)毒株，而基因1型(欧洲型)毒株在国内也偶有发现，因此在临床上需要一种能够快速诊断PRRSV美洲型毒株的检测方法。

传统的PRRSV检测方法主要包括病毒的分离与鉴定、免疫过氧化物酶单层实验(IPMA)、间接免疫荧光实验(IFA)和间接酶联免疫吸附实验(间接 ELISA)等。目前最常用核酸检测方法有常规PCR和荧光定量PCR等。传统的PRRSV检测方法存在需要使用高成本仪器设备，试验所需时间较长等不足。RT-PCR和Real-time RT-PCR虽然较之以往方法具有特异性更强、灵敏度高、重复性好，且自动化程度高等特点，但是对于操作人员的分子生物学技术背景要求很高，试剂成本很贵，难以在基层实际生产中普及应用。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，能在等温(60-65℃)条件下，短时间(通常是一小时内)内进行大量的核酸扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。与常规PCR相比，该方法不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，具有简单、快速、特异性强的特点；在灵敏度、特异性和检测范围等指标上也能媲美甚至优于PCR技术，且该方法不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。

LAMP的特征是针对靶基因上的六个区域设计四条引物，利用链置换型 DNA聚合酶在恒温条件下进行扩增反应，可在15-60分钟内实现10⁹-10¹⁰倍的扩增，反应能产生大量的扩增产物即焦磷酸镁白色沉淀，可以通过肉眼观察白色沉淀的有无来判断靶基因是否存在。LAMP方法的优势除了高特异性和高灵敏度外，操作还十分的简单，在应用阶段对仪器的要求低，一个简单的恒温装置就能实现反应，结果检测也非常简单，直接肉眼观察白色沉淀或者绿色荧光即可，不像普通PCR方法需要进行凝胶电泳观察结果，是一种适合现场、基层快速检测的方法。

荧光可视化快速检测猪繁殖与呼吸综合征美洲型毒株的RT-LAMP试剂盒是在LAMP技术的基础上添加了荧光，无需后续的电泳检测，直接在仪器上检测荧光或者肉眼判定，提高了检测的灵敏度。

发明内容