[发明专利]西罗莫司产生菌的育种方法

说明书

本发明提供西罗莫司产生菌的育种方法，将西罗莫司产生菌接入装有玻璃渣的培养瓶内，将培养瓶置于摇床振摇，振摇结束后，菌液稀释后涂平板，挑取单菌落，即为抗剪切力和西罗莫司生产能力提高的菌株。采用本发明方法对西罗莫司产生菌进行选育，所得菌株的抗剪切力和西罗莫司生产能力均有所提高，最终提高了发酵液中西罗莫司的产量。

技术领域

本发明涉及微生物育种技术，具体地说，涉及西罗莫司产生菌的育种方法。

背景技术

西罗莫司(Rapamycin)是由吸水链霉菌发酵生产的一种大环内酯类化合物，它具有抗真菌、免疫抑制、抗肿瘤、神经保护和抗衰老等活性，临床上被应用于器官移植的抗排斥反应和自身免疫性疾病的治疗。

西罗莫司是一种具有多种生物活性、有价值的天然产物，但是野生型西罗莫司生产菌种较低的西罗莫司产量却是限制其工业化生产和应用的一个重要因素。因此，提高西罗莫司发酵水平势在必行。

微生物菌株的发酵能力不仅取决于菌体本身的性能，生长环境适宜也是菌体高效表达产物的必要因素。发酵工业中，深层通氧搅拌发酵起着重要作用，其目的是使体系气液两相充分接触，强化过程的混合和传质，促进系统内培养基组分，温度、pH值和溶解氧等均匀分布，保证菌体能在良好的环境中正常生长和代谢等。但它也有不利方面，高速旋转的搅拌器剪切生产菌丝，易造成细胞损伤；搅拌转速变慢后，溶氧供应不足，发酵单位增长缓慢。搅拌最终与发酵生产能力和产品质量息息相关。

发明内容

本发明的目的是提供西罗莫司产生菌的育种方法，以提高菌株的抗剪切力和西罗莫司生产能力。

本发明构思如下：通过对种子瓶内西罗莫司产生菌的菌丝用玻璃渣进行抗剪切力筛选，获得菌丝细胞可以耐受强压力的菌株，以提高菌株在发酵罐中对剪切力的适应性，减少细胞的损伤，最终提高西罗莫司的生产能力。

为了实现本发明目的，本发明提供西罗莫司产生菌的育种方法，将西罗莫司产生菌接入装有玻璃渣的培养瓶内，将培养瓶置于摇床振摇，振摇结束后，菌液稀释后涂平板，挑取单菌落，即为抗剪切力和西罗莫司生产能力提高的菌株。

进一步地，将西罗莫司产生菌的斜面挖菌块接入种子瓶培养，培养结束后将培养成熟的菌丝接入装有玻璃渣的培养瓶内，然后将培养瓶置于摇床振摇，振摇结束后，菌液稀释后涂平板，挑取单菌落，即为抗剪切力和西罗莫司生产能力提高的菌株。

本发明中，所述西罗莫司产生菌包括但不限于吸水链霉菌(Streptomyceshygroscpicus)，如菌株FC904-25。

前述的方法，摇床培养条件为：26-30℃，260-300rpm培养30-60min，优选28℃，300rpm培养60min。

优选地，所述玻璃渣的形状为三角形，面积为0.1-0.2cm²。

本发明的西罗莫司产生菌育种方法，具体包括以下步骤：

A、斜面和种子培养：将西罗莫司产生菌传斜面，培养温度26-30℃，培养5-6天；

B、将斜面菌块接入装有液体培养基的种子瓶中，26-30℃，摇床转速250-280rpm，种子瓶装液量100ml/750ml，培养45-55h；

C、取1ml步骤B的菌液于装有9ml生理盐水和12-15g玻璃渣的三角瓶中，26-30℃，260-300rpm摇床振摇30-60min；

D、振摇结束后，所得菌液经梯度稀释后涂平板，分离得单菌落。

在本发明的一个具体实施方式中，所述方法如下：

a、将吸水链霉菌传斜面，培养温度28℃，培养5天；