[发明专利]一种肝纤维化类器官模型的体外构建方法

说明书

本发明公开了一种肝纤维化类器官模型的体外构建方法，将肝细胞、肝星状细胞、枯否细胞及肝窦内皮细胞，混悬于培养基A；培养至第4天，换为培养基B维持培养；第10天开始，换为培养基C，连续培养六天。发明基于肝脏内细胞成分比例，快速构建大小结构均一、纤维化表征明显的3D肝脏纤维化类器官体外模型。本发明构建的肝脏纤维化类器官模型，原理明确，结构稳定，方法简易，构建迅速，可操作性强，适用于肝脏纤维化发生发展机制研究，抗纤维化药物高通量筛选等，具有产业化意义。

技术领域

本发明涉及一种肝纤维化类器官模型的体外构建方法。

背景技术

肝纤维化是一种复杂的炎症反应，由长期的慢性肝损伤造成，并有极大的风险发展为肝硬化乃至肝癌。病原学显示，多种因素与肝纤维化相关，如肝炎病毒感染，过量饮酒，自身免疫性疾病，肥胖等。肝纤维化可被定义为广泛性的瘢痕形成过程，并伴随内部构成及功能改变。其中肝星状细胞激活引起的细胞外基质分泌异常在肝纤维化中扮演着极其重要的作用。因此，以往肝纤维化的体外模型往往基于肝星状细胞的普通2D培养。尽管对于纤维化机制研究及药物筛选显示一定的参考价值，但普通单层培养并不能很好的模拟肝脏生理及病理状态下的微环境，例如缺乏细胞-细胞，细胞-胞外基质间的相互作用。因此，考虑到肝脏组织中成分的复杂性，一种新的模拟肝脏纤维化微环境的3D模型亟待开发。

类器官技术是一种利用哺乳动物多能干细胞、成体组织来源的干细胞或成体细胞的特性构建的模拟体内特性，并具有多细胞类型的体外模型。近来多项研究报道，这些有复杂内部结构的类器官，在功能及构造上已经趋近于相应体内结构。这种技术为研究组织器官的生理病理状态，及药物筛选提供了理想的平台。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速简易的肝纤维化类器官模型的体外构建方法，本发明提供的方法可以在较短时间内得到大小结构均一、纤维化表征明确的肝纤维化类器官模型，为进一步肝纤维化机制研究及药物筛选提供平台。

本发明的技术解决方案是：

一种肝纤维化类器官模型的体外构建方法，其特征是：包括下列步骤：

将肝细胞、肝星状细胞、枯否细胞及肝窦内皮细胞，混悬于培养基A；培养至第4天，换为培养基B维持培养；第10天开始，换为培养基C，连续培养六天；

所述培养基A包括：牛胰岛素、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、氢化可的松、谷氨酰胺（GlutaMAX）、胎牛血清、I型鼠尾胶原蛋白和无酚红威廉姆斯E培养基(William's EMedium)。

所述培养基B包括：庆大霉素、转铁蛋白（Transferrin）、维生素C，牛胰岛素、胎牛血清、亚硒酸钠、亚油酸、氢化可的松、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、谷氨酰胺（GlutaMAX）、人表皮生长因子（HEGF）和HBM肝细胞基础培养基；

所述培养基C包括：庆大霉素、转铁蛋白（Transferrin）、维生素C、牛胰岛素、胎牛血清、亚硒酸钠、氢化可的松、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、谷氨酰胺（GlutaMAX）、转化生长因子-β(TGF-β)、人表皮生长因子（HEGF）和HBM肝细胞基础培养基。

将肝细胞、肝星状细胞、枯否细胞及肝窦内皮细胞，使用计数仪计数，按7:1.5:0.5:1的特定比例，混悬于培养基A。

将肝细胞、肝星状细胞、枯否细胞及肝窦内皮细胞按特定比例混匀于A后，计数后按每孔1200个细胞使用排枪均匀地接种于超低吸附圆底细胞板，每孔接种细胞混悬液的体积为100µL。

肝细胞、肝星状细胞、枯否细胞及肝窦内皮细胞按比例混悬于培养基A，接种于超低吸附圆底细胞板，然后放入37℃二氧化碳培养箱，静置3天，尽量避免移动。

培养至第4天，使用微量移液枪，紧贴培养基液面，吸出旧培养基；再沿孔壁缓慢加入100µL培养基B，隔日吸弃孔中50µL培养基，并加入等量培养基B，持续培养6天。