[发明专利]基于夹心法高分辨熔解曲线分析的ALK融合基因检测及分型试剂盒

权利要求书

1.一种检测肺癌ALK融合基因分型的试剂盒的非诊断或治疗目的的使用方法，其特征在于，所述试剂盒包括PCR引物组合物，所述引物组合物包括ALK基因特异性接头引物、ALK融合伴侣基因特异性接头引物、接头引物以及内参基因扩增特异性接头引物，所述ALK基因特异性接头引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，ALK融合伴侣基因特异性接头引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2~ SEQ ID NO:16，所述接头引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示，所述内参基因特异性接头引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:19和SEQ IDNO:20所示；

所述试剂盒按照如下方法用以检测肺癌ALK融合基因的分型：

（1）提取待测样本中的总RNA，通过反转录合成cDNA；

（2）以步骤（1）的合成cDNA为模板，以所述ALK基因特异性接头引物、ALK融合伴侣基因特异性接头引物、接头引物和内参基因特异性接头引物作为组合引物，进行PCR扩增反应；

（3）将步骤（2）获得的PCR反应产物用于高分辨熔解曲线分析，根据样品的高分辨熔解曲线峰形判定ALK融合基因有无；

（4）在步骤（3）中，若判定为ALK融合基因阳性，则对于该样品的高分辨熔解曲线，通过背景去除和标准化后的高分辨熔解曲线求导获得熔解曲线导数图，对于该导数图进行二次求导，获得二阶导数曲线；

（5）在熔解曲线导数图的低温熔解曲线峰和高温熔解曲线峰区间内判断二阶导数曲线是否单调递增；

（6）当在步骤（5）中判定为二阶导数曲线是单调递增时，应用高、低温熔解曲线峰Tm值之间的间距∆Tm和高温荧光释放加速度峰值间温度跨度PTS的二维坐标系判断样品的融合类型；当在步骤（5）中判定为二阶导数曲线不是单调递增时，应用高、低温熔解曲线峰Tm值之间的间距∆Tm和首次达到区间内荧光释放加速度峰值温度跨度ITS的二维坐标系判断样品的融合类型。

2.根据权利要求1所述的试剂盒的非诊断或治疗目的的使用方法，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应试剂和双链DNA染料。

3.根据权利要求1所述的试剂盒的非诊断或治疗目的的使用方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述的PCR扩增反应的反应体系中，所述的ALK基因特异性接头引物、ALK融合伴侣基因特异性接头引物、接头引物和内参基因特异性接头引物的摩尔浓度比为1~3：1~3：8~20：1。

4.根据权利要求1所述的试剂盒的非诊断或治疗目的的使用方法，其特征在于，在步骤（6）中，根据二维坐标系判断样品的融合类型时，所述判断基于各类型ALK融合基因标准品计算的关键参数取值可信区间，所述关键参数为高温熔解曲线峰Tm值和低温熔解曲线峰Tm值之间的间距∆Tm、高温荧光释放加速度峰值间温度跨度PTS、首次达到区间内荧光释放加速度峰值温度跨度ITS。