[发明专利]糖代谢与脂质代谢协同提高解脂耶氏酵母合成脂肪酸衍生物的产量的应用

说明书

本发明涉及合成生物学技术领域，特别涉及糖代谢与脂质代谢在协同提高解脂耶氏酵母合成脂肪酸衍生物的产量的应用。协同脂肪醇与糖代谢路径的表达可以实现脂质产物生产与其他相关路径的平衡与协调从而促进细胞代谢的合理分配提高脂质合成效率。本发明通过实验发现当协同糖酵解与脂质产物生产路径时，可以实现有效的“拉‑推”效应，既脂质产物生产会拉动糖酵解表达上调，而糖酵解可以协同的进一步促进脂质产物合成基因的表达，从而大大的提高了整体代谢通量，实现了脂质类产物的高效生产。另一方面，协同表达也有利于实现动态调控，使得产物的生产可以依据细胞的不同代谢状态实时进行调整，从而进一步优化了细胞工厂的生产效率。

技术领域

本发明涉及合成生物学技术领域，特别涉及糖代谢与脂质代谢协同提高解脂耶氏酵母合成脂肪酸衍生物的产量的应用。

背景技术

中长链脂肪酸衍生物(C8-C18)——脂肪醇(Fatty alcohol，FOH)，脂肪酸乙酯(fatty acid ethyl ester，FAEE)，特殊脂肪酸(unusual fatty acid)等具有作为表面活性剂，生物柴油，化工原料，营养保健品等多种用途，市场需求日益增长，具有很高的经济价值。

由于脂肪酸类物质是微生物主要储能物质以及生物膜的重要组分，所以大多数细胞天然含有中长链(C16，C18)脂肪酸以及脂酰辅酶A的完整合成路径，其对应的脂肪酸类衍生物的生产主要是通过引入对应的还原酶或修饰酶来实现的。酵母中脂肪醇的生产，主要可以通过两种途径：一种是以细胞内自由脂肪酸(free fatty acid，FFA)为前体物，通过羧酸还原酶(carboxylic acid reductase)还原为脂肪醛，之后所得的醛再通过醇脱氢酶(alcoholdehydrogenases)还原得到脂肪醇。另一种是通过脂酰辅酶A还原酶(fatty acyl-CoA reductase，FAR)直接将胞内脂酰辅酶A一步还原为脂肪醇，并在绝大部分细胞中均展现了十分高效的催化能力。其它底盘细胞也可以通过脂酰ACP为前体合成脂肪醇。Liu等在引入FAR表达的基础上，通过构建“脂肪酸饥饿”策略并结合敲除脂酰ACP硫酯酶(acyl-ACPthioesterases)，成功使得大肠杆菌脂肪醇摇瓶产量达到2.024g/L，代表了目前原核细胞最高脂肪醇产量。在酿酒酵母酵母中，d'Espaux等通过综合不同FAR来源与细胞器定位筛选，碳代谢流“推-拉-堵”改造以及平衡辅因子供给等多种策略，使得其脂肪醇摇瓶产量达到1.2g/L，是目前酿酒酵母中的最高产量。而在2015年，Fillet等通过在产油酵母——圆红冬孢酵母中引入FAR酶，成功实现了摇瓶2g/L的脂肪醇产量，这说明了产油微生物(人们把油脂含量可以达到自身生物量20％以上的微生物称为产油微生物)对于脂肪酸衍生物巨大的合成潜力。

解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)是一种需氧的无致病性的二型性非常规酵母。作为产油微生物)的一种，解脂酵母具有很强的耐受、吸收、同化、贮藏油脂的能力；另一方面，它也是唯一完成完整测序以及具有完整遗传操作手段的产油酵母，被广泛用于生物脂质类产物的生产。目前解脂酵母中脂肪醇的生产主要是通过FAR途径进行的。Wang等通过引入FAR并利用两相发酵方法来减少脂肪醇对于细胞的生长毒性，使得解脂酵母中脂肪醇摇瓶产量达到167mg/L。Xu等在解脂酵母内表达FAR的同时过表达大肠杆菌来源的脂酰辅酶A合成酶(fatty acyl-CoA synthetase，EcfadD)，提高了脂肪醇合成的前体供给，使得摇瓶产量提高至205.4mg/L。在综合3模块优化(优化前体供给，FAR表达与降低内源分解)的策略后，Wang等通过继续优化发酵培养条件，使得解脂酵母发酵罐脂肪醇产量达到690mg/L。

虽然解脂酵母中已经能够合成出脂肪醇，并在结合传统代谢工程的改造后产量有了十分明显的提高，但是其产量还远远达不到工业应用的要求。现有的这些研究大多着眼于脂质合成路径本身的改造优化，然而很多研究发现其他代谢路径，像是磷酸戊糖途径，柠檬酸循环，氨基酸合成通路等，也对脂质类产物的合成具有很大影响。这些路径为脂质合成提供原料与辅因子，同时也参与影响胞内代谢信号传递与代谢的全局调控，从而影响对于脂质合成路径的基因表达与代谢通量。