[发明专利]一种利用RNA干扰技术提高植物抗虫性的方法及其专用DNA片段

说明书

本发明提供了一种利用RNA干扰技术提高植物抗虫性的方法及其专用DNA片段，DNA片段如式（I）所示：SEQ_正向‑X‑SEQ_反向（I），其中，SEQ_正向是棉铃虫几丁质脱乙酰基酶5a基因的全长cDNA片段中的至少包括21bp的任何一段；SEQ_反向与所述SEQ_正向反向互补；X是SEQ_正向与SEQ_反向之间的间隔序列，X与所述SEQ_正向和SEQ_反向均不互补，所述棉铃虫几丁质脱乙酰基酶5a基因的全长cDNA如序列表中的序列1所示。本发明首次将棉铃虫几丁质脱乙酰基酶5a基因作为RNA干扰靶标基因，并应用于培育抗虫性提高的转基因植物中。虫试结果表明，转接后2天到5天棉铃虫幼虫的体重小于对照组体重的1/10；5天转基因烟草叶片上的幼虫死亡率达到68%，野生型烟草只有21%。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用RNA干扰技术提高植物抗虫性的方法及其专用DNA片段。

背景技术

真核细胞摄入dsRNA（双链RNA），会引起细胞内源同源mRNA的降解，从而造成对应基因表达受阻，这种现象被称之为RNA干扰（RNA interference, RNAi）。植物介导的RNAi技术是通过转基因技术，把表达昆虫基因的dsRNA（或者hpRNA，即发夹结构RNA）的基因表达盒导入到植物中，害虫取食这种含害虫基因dsRNA/hpRNA植物材料后，摄入的dsRNA/hpRNA会引起害虫的RNAi，有可能会起到抑制昆虫生长发育甚至杀死害虫的作用，从而达到保护植物的目的。

2007年，Mao YB等在棉花中表达与棉酚解毒代谢直接相关P450基因（CYP6AE14）的dsRNA，饲喂棉铃虫后，CYP6AE14基因的表达水平显著降低，同时棉铃虫对棉酚的耐受性减弱，提高了棉酚对棉铃虫的毒性【非专利文献： Mao YB, Cai WJ, Wang JW, et al.Silencing a cotton bollworm P450 monooxygenase gene by plant-mediated RNAiimpairs larval tolerance of gossypol. Nat Biotechnol, 2007, 25(11): 1307-1313.】。同年，Baum等先通过饲喂dsRNA试验从玉米根萤叶甲的290个候选靶标基因筛选出液泡ATP酶基因（vacuolar ATPase, V-ATPase），然后将其转入玉米使转基因植株表达dsRNA，结果表明在防治玉米根萤叶甲有很好的效果【非专利文献：Baum JA, Bogaert T,Clinton W et al. Control of coleopteran insect pests through RNAinterference. Nat Biotechnol, 2007, 25: 1322-1326.】。上述奠基性工作开创了植物抗虫基因工程研究领域的一个热点。

植物介导的RNAi技术具有抗虫基因来源广、基因特异性强、残留低等优点。然而正是由于基因来源广泛，寻求合适的靶标基因成为该技术的关键点和难点。

几丁质脱乙酰基酶（chitin deacetylase，CDA）参与昆虫几丁质的降解与修饰，催化几丁质转化为壳聚糖（其中的N-乙酰基葡糖胺的乙酰基的水解）。CDA的对昆虫生长发育的重要作用已经得到证实。

2005年Guo等首次在粉纹夜蛾中肠cDNA文库中分离到CDA的cDNA序列，此基因编码的蛋白质能与几丁质相互结合，提出该蛋白的功能可能与围食膜的形成及更新有关。此后，在多种昆虫上进行了CDA编码基因的分子克隆及其表达分析研究。