[发明专利]一种蛇足石杉离体组织培养、繁殖与保存的方法

说明书

本发明公开了一种蛇足石杉离体组织培养、繁殖与保存的方法，建立了蛇足石杉组织培养过程中最佳快速繁殖体系，包括最适宜的外植体的选择方法，高效的多重灭菌方法；解决了不同基因型的蛇足石杉离体生长繁殖与保存等关键技术问题，最终实现蛇足石杉在短时间内大量、快速、高质量的繁殖与保存。本发明可离体再生来源不同省份、不同基因型的蛇足石杉，离体的蛇足石杉组织能产石杉碱甲。这可以有效地满足人们对蛇足石杉日益增长的需求，进而减少人们对野生蛇足石杉的破坏，有利于野生蛇足石杉的保护，具有巨大的科研价值、经济价值和生态价值。

技术领域

本发明属于植物生物技术与细胞工程技术领域，涉及蛇足石杉离体组织培养繁殖方法。

背景技术

蛇足石杉(Huperzia serrate(Thunb)Trev.)，又名千层塔、蛇足石松、蛇足草等，为石杉科石杉属蕨类植物，全草具有解毒、止痛、散瘀消肿功效。蛇足石杉在自然条件下有两种方式，一通过孢子繁殖，孢子在地下形成配子体所需萌发周期长，从孢子萌发到植株成熟需6-15年才能成熟；二通过芽孢繁殖，但种方式繁殖极少发现，因此野生资源的再生受到极大的限制。

自1972年中国首次报道，蛇足石杉中所含的生物碱—石杉碱甲(Huperzine A)在动物试验中有松弛横纹肌的作用后，大量实验结果表明Huperzine A是一种高效、低毒、可逆、高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂，可用于改善记忆力、治疗重症肌无力和老年性痴呆等疾病，并对抑制有机磷酸中毒有一定功效。石杉碱甲的化学合成是化学合成研究的热点，但目前所报道的合成方法都具有一定的局限性，无法人工合成具有高效生物活性的石杉碱甲，从植物中提取石杉碱甲依旧是最有效的途径。

然而，在自然条件下，蛇足石杉自然繁殖非常困难，而且生长缓慢，从孢子萌发到长成一个完整的植株需要大约15年时间，株高仅为几厘米到十几厘米，无法满足人们对蛇足石杉日益增长的需求，导致蛇足石杉植株被大规模掠夺性采集，其野生自然资源日益减少，使该种药材资源的再生受到了极大限制，以致蛇足石杉的人工繁殖问题备受关注。盛束军等、覃大吉等研究探索了蛇足石杉的扦插育苗或人工驯化的栽培繁殖体系，为蛇足石杉资源的可持续开发利用奠定了一定的技术基础，但还没能产业化推广。沈晓霞等采用蛇足石杉茎尖为外植体进行组织培养，发现其灭菌十分困难，虽然多次灭菌，仍然很难获得成功。近年来，涂艺声课题组虽然通过组织培养得到了取自江西庐山的蛇足石杉原叶体，但人们发现蛇足石杉离体再生体系的重复性仍很低，并且由于不同地区、不同基因型的蛇足石杉中的石杉碱甲含量有明显差异。研究也表明，基因型的差异对植物组织培养离体再生具有很大的影响。所以建立不同地区来源、不同基因型的蛇足石杉的离体繁殖体系具有十分重要的意义，为从根本解决石杉碱甲生产原料的瓶颈奠定基础。

参考文献：

(1)郭斌,徐玲玲,尉亚辉,等.千层塔的研究进展[J].中国中药杂志,2009,34(16):2018-2023.

(2)盛束军,徐建中,王志安,等.千层塔扦插繁殖研究[J].资源开发与市场,2000,16(5):268-269.

(3)覃大吉,杨永康,向极钎,等.千层塔NFT扦插育苗技术研究[J].湖北民族学院学报(自然科学版)2010,28(1):18-21

(4)吉枝单，涂艺声，陈曼，等.蛇足石杉离体培养产石杉碱甲的条件优化及动力学研究[J].中草药,2016,47(3):488-492.

(5)沈晓霞,俞旭平.千层塔茎尖组织培养灭菌方法的研究[J].中国中药杂志,2002,27(6):458-459.

(6)王德立,甘炳春,齐耀东,等.蛇足石杉不同生长阶段植株中石杉碱甲含量的地区差异及生境影响的比较观察[J].中国新药杂志,2014,23(3):326-332.

(7)陈劲枫主编.植物组织培养与生物技术.科学出版社,2018,pp 22-23.