[发明专利]一种甲酰基肽定向进化噬菌体及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种甲酰肽定向进化噬菌体的制备方法,其特征在于，包括如下步骤：

1)将M13K07噬菌体PⅢ展示Pcantab 5E质粒依次采用Not I和Sfi I酶切后电泳，切胶回收得到双酶切质粒载体；

2)设计甲酰基肽编码DNA序列，并在其5’端和3’端分别引入限制性酶酶切位点，合成目的序列,加热退火后得到双链插入片段；所述甲酰基肽的一级结构通式为：WYKMVM及其他变形；

3)将所述步骤1)得到的双酶切质粒载体和步骤2)得到的插入片段通过T4DNA连接酶反应得到重组质粒；

4)将所述步骤3)得到的重组质粒转化感受态End A⁺细胞，铺平板，挑取单克隆，扩增得到阳性菌，提取质粒，测序验证插入片段的完整性；

5)将步骤4)得到的阳性菌与M13K07辅助噬菌体共培养，扩增、分离得到甲酰基肽定向进化噬菌体。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中甲酰基肽的核苷酸序列如下：

(1)其正向编码DNA为FPR2-F，选自以下序列之一：

a、具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列；

b、具有SEQ ID NO:2所示序列经改变、缺失或增加一个或几个核苷酸但仍表达具有甲酰基肽活性多肽的核苷酸序列；

(2)其反向编码DNA序列为FPR2-R，选自以下序列之一：

a、具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列；

b、具有SEQ ID NO:3所示序列经改变、缺失或增加一个或几个核苷酸但仍表达具有甲酰基肽活性多肽的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中感受态End A⁺细胞为TG1、ER2378、JM109中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中噬菌体扩增和扩增方法为：在2×YT培养基中接种菌种，37℃条件下100-300rpm振荡培养直至菌液OD600达到0.5-2.0之间，加入M13K07辅助噬菌体，继续培养5h以上；将菌液在7000-12000rpm条件下离心10-30min；取上清，采用PEG沉淀法分离噬菌体；加入灭菌超纯水溶解产物，经冷冻干燥后得到甲酰基肽定向进化噬菌体干粉。

5.权利要求1-4任一项所述的制备方法得到的甲酰基肽定向进化噬菌体。

6.权利要求5所述的甲酰基肽定向进化噬菌体在人工血管、智能皮肤和骨修复支架中的应用。