[发明专利]细胞共培养下生长缺陷的牛支原体突变株及应用

说明书

本发明属于动物传染病防制技术领域，具体涉及细胞共培养下生长缺陷的牛支原体突变株及应用,从牛支原体基因突变体库中筛选得到一株牛支原体Mbov_0328基因缺失突变菌株T9.386，该基因编码环二核苷酸磷酸二酯酶。突变菌株与牛胚胎肺细胞共培养时，表现出显著生长缺陷表型；在PPLO固体培养基上表现为小菌落形态。所述的突变株与野生菌株间的蛋白组学呈现显著的差异表达谱。突变菌株间具有38个差异表达蛋白，其中30个蛋白呈上调表达，8个蛋白呈下调表达。该突变株可在牛支原体代谢生理、致病和免疫防制领域应用。

技术领域

本发明属于动物传染病防制技术领域，具体涉及到细胞共培养下生长缺陷的牛支原体突变株及应用。从牛支原体基因突变体库中筛选得到一株牛支原体Mbov_0328基因缺失突变菌株T9.386，该基因编码环二核苷酸磷酸二酯酶(CDNPase)。突变菌株与牛胚胎肺细胞(EBL)共培养时，表现出显著的生长缺陷表型，在PPLO固体培养基上表现为小菌落形态。所述的突变株与野生菌株间的蛋白组学呈现显著的差异表达谱。该突变株可望在牛支原体致病和免疫防制中应用。

背景技术

牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)是牛的一种重要病原体，可以引起牛的肺炎、关节炎、乳腺炎及角膜结膜炎等症状。牛支原体于1961年首次在美国从患乳腺炎奶牛的牛奶中分离得到，1976年证实其是导致肺炎。任何月龄肉牛和奶牛对该病均易感。牛支原体肺炎的发病率可达80％，平均病死率为10％。目前，牛支原体病在世界范围内广泛流行，已成为危害养牛业的主要传染病和常发病，给全球养牛业带来了严重的经济损失。美国每年由于牛支原体感染所致牛呼吸系统疾病和乳腺疾病造成的损失达1.4亿美元，单个牛场最高感染率可达70％(Rosengarten等，1999)。在英国，每年约有190万头牛患牛支原体肺炎，导致的经济损失达到5400万英镑(NicholasAyling，2003)。

2008年，湖北省从外地引进的肉牛中爆发呼吸道疾病，牛群引进后2周左右发病，表现为发热，咳嗽，流鼻涕，犊牛和体质弱的牛发病严重。华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原分室通过病原分离鉴定，在全国确定该病为“传染性牛支原体肺炎”。此后牛支原体肺炎被报道呈全国性流行，主要发生在新引入的育肥牛中，一般在引入后10-15天左右发病，发病率为80％以上。该病临床治疗效果差，病程长，病死率高，平均为10％，高达到60％(石磊等，2008)。该病的发生与我国肉牛养殖产业化的快速发展直接相关。由于我国养牛业向规模化和集约化发展，牛养殖量大大增加，专门化程度大幅度提高，肉牛“异地育肥”已经成为重要的肉牛养殖模式，全国出现大规模的“北牛南调、西牛东运”的牛群转运现象。架子牛反复倒运引起的运输应激成了该病暴发流行的诱因(郭爱珍等，2011)。与此同时，因奶牛牛支原体乳腺炎导致初生犊牛牛支原体肺炎的流行，给奶牛业带来重大损失。

然而，由于支原体本身的生物学特征及研究手段有限，50多年来一直缺乏针对该病原体的特异性防控手段，既无有效疫苗也无特效药物。阐明其毒力机制和致病机理是研究特效防治措施的前提条件。但目前对牛支原体的毒力机制仍知之甚少，尚未发现其具有经典的毒素和毒力因子和毒力岛。为发掘牛支原体的毒力基因，申请人构建了牛支原体突变体库，利用细胞共培养存活模型、细胞黏附和侵袭模型等，鉴定了一系列相关基因的突变体。本发明涉及一株与牛胚胎肺细胞共培养时存活能力缺陷的突变体，确定其突变基因为Mbov_0328，该基因编码蛋白为环二核苷酸磷酸二酯酶(CDNPase)。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一株牛支原体Mbov_0328基因突变菌株。该基因的编码蛋白为环二核苷酸磷酸二酯酶(CDNPase)。与野生菌株比较，突变菌株与牛胚胎肺细胞共培养时，呈现出显著的生长缺陷，在PPLO固体培养基上呈现小菌落表型，表现显著的蛋白组差异表达。有研究表明该突变菌株生长缺陷表型与缺失基因的酶活性相关。基于牛支原体与细胞共培养下的存活能力与毒力相关，该突变株可望在牛支原体致病、生理代谢和免疫防制等领域有潜在应用前景。