[发明专利]一种针对多发性骨髓瘤的CAR-NK细胞制备方法

说明书

本发明公开了一种针对多发性骨髓瘤的CAR‑NK细胞制备方法。该方法包括如下步骤：使NK细胞表达融合蛋白，得到针对多发性骨髓瘤的CAR‑NK细胞；所述融合蛋白为将NK细胞表面激活受体CD244的IgG样结构域更换为针对多发性骨髓瘤标志物BCMA的特异性抗体后得到的重组蛋白。所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。本发明的技术方案对于具有多发性骨髓瘤标志物BCMA的肿瘤的治疗具有积极效果，可以用于具有多发性骨髓瘤标志物BCMA的肿瘤(如多发性骨髓瘤)的治疗。本发明具有重大的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种针对多发性骨髓瘤的CAR-NK细胞制备方法。

背景技术

近年来，嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)修饰的T细胞(CAR-T)在白血病研究中取得了重大突破，为血液肿瘤患者带来了新的希望。但是伴随着对血液肿瘤显著疗效的同时，CAR-T治疗也存在着一些问题，比如脱靶效应、细胞因子风暴、插入突变等，并且对实体瘤尚未取得显著疗效。研发新的具有强大抗肿瘤作用的效应细胞具有重要的理论意义和临床应用价值。

NK细胞因其特殊的识别靶细胞的机制、短暂的生理周期、广泛的肿瘤杀伤能力等优势，被视为同样有潜力通过CAR修饰增强其抗肿瘤能力的效应细胞。NK细胞是一类对肿瘤细胞具有强力杀伤作用且MHC非依赖的淋巴细胞，其对肿瘤细胞的识别主要依赖于其表面活化性受体和抑制性受体的相互交叉调控。当识别肿瘤细胞之后，NK细胞通过释放杀伤介质穿孔素和颗粒酶使靶细胞凋亡、表达膜TNF家族分子诱导靶细胞凋亡和抗体依赖的细胞毒作用等多种途径杀伤肿瘤细胞。但是由于肿瘤患者体内NK细胞数量、质量的下降和肿瘤逃逸机制的存在，其在体内的抗肿瘤功能未能得到充分发挥。通过CAR修饰NK细胞有望增强其靶向杀伤肿瘤细胞的能力并研制出具有强大抗肿瘤作用的效应细胞。

多发性骨髓瘤(MM)是一种恶性浆细胞病，其肿瘤细胞起源于骨髓中的浆细胞，而浆细胞是B淋巴细胞发育到最终功能阶段的细胞。因此多发性骨髓瘤可以归到B淋巴细胞淋巴瘤的范围。目前WHO将其归为B淋巴细胞淋巴瘤的一种，称为浆细胞骨髓瘤/浆细胞瘤，其特征为骨髓浆细胞异常增生伴有单克隆免疫球蛋白或轻链(M蛋白)过度生成，极少数患者可以是不产生M蛋白的未分泌型MM。多发性骨髓瘤常伴有多发性溶骨性损害、高钙血症、贫血、肾脏损害。由于正常免疫球蛋白的生成受抑，因此容易出现各种细菌性感染。目前没有针对多发性骨髓瘤的CAR-NK细胞免疫治疗技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备针对多发性骨髓瘤的CAR-NK细胞的方法。

第一方面，本发明要求保护一种制备针对多发性骨髓瘤的CAR-NK细胞的方法。

本发明所提供的制备针对多发性骨髓瘤的CAR-NK细胞的方法，可包括如下步骤：使NK细胞表达融合蛋白，得到针对多发性骨髓瘤的CAR-NK细胞。所述融合蛋白可为将NK细胞表面激活受体CD244(2B4)的IgG样结构域更换为针对多发性骨髓瘤标志物BCMA的特异性抗体后得到的重组蛋白。

所述NK细胞表面激活受体CD244(2B4)的IgG样结构域的氨基酸序列具体可如序列表中序列3所示。

所述针对多发性骨髓瘤标志物BCMA的特异性抗体的氨基酸序列具体可为SEQ IDNo.1的第22-260位所示。

进一步地，所述方法可包括如下步骤：将含有所述融合蛋白的编码基因的重组载体导入NK细胞，得到表达所述融合蛋白的NK细胞，即为所述针对多发性骨髓瘤的CAR-NK细胞。

其中，所述融合蛋白自N端到C端依次由CD244(2B4)的上膜信号区、单链抗体区和“CD244(2B4)的跨膜结构与CD244(2B4)的胞内结构区”组成。

所述CD244(2B4)的上膜信号区的氨基酸序列可为SEQ ID No.1的第1-21位所示。