[发明专利]一种牛支原体蛋白基因MbovGdpP及其应用

说明书

本发明属于动物传染病防制技术领域，具体涉及牛支原体蛋白基因MbovGdpP及其应用。Mbov_0276根据牛支原体HB0801基因组序列人工合成获得。针对大肠杆菌对密码子的偏爱性，对Mbov_0276基因进行了修饰：将牛支原体色氨酸密码子UGA突变成大肠杆菌中编码色氨酸的密码子UGG，得到大肠杆菌重组蛋白rMbovGdpP。Mbov_0276基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码的蛋白质序列如SEQ ID NO:2所示。突变株T6.290出现生长缺陷表型，在PPLO培养基上呈小菌落形态，对EBL细胞黏附减少，对盐离子的敏感性升高。该突变株可望在牛支原体致病机理和制备免疫防制药物中应用。

技术领域

本发明属于动物传染病防治技术领域，具体涉及到牛支原体蛋白基因MbovGdpP及其应用，该蛋白可以降解环二核苷酸，超小片段核酸，ATP和ADP，编码该蛋白的基因为Mbov_0276，其突变菌株T6.290。相较于野生菌株，突变菌株表现显著的细胞共增减下生长缺陷，小菌落形态表型，黏附能力降低，对盐离子包括钾离子和钠离子的耐受能力显著降低。

背景技术

牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)是牛的一种重要病原体，引起牛肺炎、乳腺炎、关节炎等多种症状。1961年首次在美国乳腺炎患牛的乳液中发现，1976年首次报道该病原导致牛肺炎。目前，牛支原体病在世界范围内广泛流行，已成为危害养牛业的主要传染病和常发病，给全球养牛业带来了严重的经济损失。我国于1983年首次报道从乳房炎患牛的乳汁中分离到牛支原体(黎济申，1983)。2008年，在湖北省从外地引进的肉牛中爆发呼吸道疾病，华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原分室通过病原分离鉴定，率先在全国确定该病为“传染性牛支原体肺炎”，此后牛支原体肺炎呈全国性流行，该病临床治疗效果差，死亡率高，平均死亡率为10％，最高可达到60％(石磊等，2008)。由于缺少特异高效的防治措施，该病给我国养牛业造成了巨大的经济损失。但目前对牛支原体的毒力机制仍知之甚少，尚未发现经典的细菌毒素和毒力因子(Qi et al.,2012)。阐明其毒力机制和致病机理是研究特效防治措施的前提条件。

c-di-AMP是2008年最新发现的一种存在于细菌内的小分子第二信使(Romling U,2008)，该信号分子对许多细胞过程具有调控作用，如孢子形成、脂肪酸合成、DNA损伤反应、钾离子运输、抗生素耐药性以及细菌毒力等(Tazin Fahmi et al,.2017)。c-di-AMP内环境稳态对细菌正常生理活动至关重要，含量升高或降低均会对细菌产生重大影响。细菌内环二核苷酸的浓度是由降解酶和合成酶决定的。目前DHH/DHHA1结构域的磷酸二酯酶活性已经在一些细菌中进行了研究，证实它们是c-di-AMP特异性降解酶，在环二核苷酸的降解过程中发挥重要作用(Huynh TN and Woodward JJ,2016)。缺失该基因会导致细菌出现一系列功能异常，包括如细菌的耐药性，细菌生长和生物被膜的形成，同时会显著降低病原菌对宿主的感染性及毒力等。目前环二核苷酸作为第二信使的研究在支原体属中刚刚起步，因此，牛支原体的环二核苷酸磷酸二酯酶相关功能的研究将对阐明支原体属成员的相关生理活动和致病机制研究具有重要参考价值。本发明涉及一株与牛胚胎肺细胞共培养时存活能力缺陷的突变体，其突变基因为Mbov_0276，编码蛋白为环二核苷酸磷酸二酯酶(MbovGdpP)。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种牛支原体MbovGdpP蛋白及其突变菌株，该蛋白可以降解环二核苷酸，超小片段核酸，ATP和ADP，编码该蛋白的突变菌株T6.290相较于野生菌株表现显著的生长缺陷及小菌落形态表型；该突变菌株的黏附能力，对盐离子包括钾离子和钠离子的耐受能力较野生菌株显著降低。