[发明专利]多重荧光PCR鉴别四种蜂花粉的方法、组合物和试剂盒

说明书

本发明涉及花粉中玫瑰花粉、虞美人花粉、猕猴桃花粉和柳树花粉的单重和多重实时荧光PCR物种鉴别方法。本发明还涉及用于所述方法的寡核苷酸引物探针组合物，包含所述引物及探针的试剂盒，以及利用其检测花粉中上述植物成分的方法。使用本发明的组合物进行单重和多重实时荧光PCR检测，能够通过简单、快速、特异且灵敏地检测花粉、花粉豆、花粉片等花粉制品中玫瑰、虞美人、猕猴桃和柳树成分。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于定性检测花粉中玫瑰、虞美人、猕猴桃和柳树成分的单重和多重Taqman实时荧光PCR方法，用于所述方法的寡核苷酸引物探针组合物，以及包含所述组合物的试剂盒，以及使用所述引物和探针或试剂盒检测花粉中玫瑰、虞美人、猕猴桃和柳树成分的方法。本发明还涉及所述引物和探针在检测蜂花粉中上述植物成分的应用。

背景技术

蜂花粉种类繁多，既包括油菜、茶花、荷花、玫瑰等常规品种，也有猕猴桃、虞美人等稀缺品种。蜂花粉营养价值十分丰富，包括碳水化合物、不饱和脂肪酸、蛋白质、维生素、微量元素、黄酮物质及其它生理活性物质，其中蜂花粉的抗氧化、预防前列腺和心血管疾病等功效已经得到国内外科学家和医疗领域的认可。我国是世界上养蜂数量最多的国家，也是蜂花粉生产及出口大国，蜂花粉作为一种优良的营养食品，及其产品市场高速增长。据统计，我国蜂花粉年产量约4万吨，2015年出口蜂花粉2269吨，比2014年增长25%，在药品、食品、保健食品、化妆品领域具有很大的商业价值。

随着社会的变化与科学技术的发展，蜂蜜作为一种优良的营养食品，人们越来越关注蜂蜜的质量与安全。随之而来的是，蜂花粉的品种来源、质量优劣、掺假与否，营养价值成为关注的焦点。而目前国内蜂花粉质量检测、活性成分分析和评价技术研究比较滞后，中国药典2010年版标准一直沿用1995 年版质量标准，检验项目和检验方法未作任何的修订与提升，食用安全性以及产业发展前景让人担忧。

实时荧光PCR在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测，不仅可以进行定性分析，还可以通过建立标准曲线对未知模板进行定量分析，广泛应用于食品真伪鉴别的诸多领域。本研究以玫瑰、虞美人、猕猴桃和柳树花粉等不同植物来源蜂花粉为研究目标，设计和筛选特异性引物探针，建立不同来源蜂花粉特异性检侧实时荧光PCR技术，分析其特异性，绝对灵敏度，相对灵敏度等。以保证蜂花粉检测的特异性、覆盖度、准确性、灵敏度。

发明内容

本发明的目的在于高通量、简单、快速、特异且灵敏地检测蜂花粉及产品中的玫瑰、虞美人、猕猴桃和柳树成分，能对蜂花粉及产品中的物种成分进行真伪鉴别，能有效防止蜂花粉中掺杂非标识或廉价花粉。

本发明的发明人根据玫瑰、虞美人、猕猴桃和柳树的ITS基因，设计了能特异性检测玫瑰、虞美人、猕猴桃和柳树成分的引物和探针，其中玫瑰序列为77 bp，虞美人靶序列为65 bp左右，猕猴桃序列为185 bp，柳树序列为88 bp，片段均在200 bp以内，目的片段较短，保证能从不同加工程度的蜂花粉品中检测目标植物成分。