[发明专利]低岩藻糖细胞系及其应用在审
| 申请号： | 201910129277.7 | 申请日： | 2012-03-05 |
| 公开（公告）号： | CN109797138A | 公开（公告）日： | 2019-05-24 |
| 发明（设计）人： | D·黑尔曼;M·巴尔-西蒙;M·托耶斯特-阿契杜夫 | 申请（专利权）人： | 默克雪兰诺有限公司 |
| 主分类号： | C12N5/10 | 分类号： | C12N5/10;C07K16/00;C07K19/00 |
| 代理公司： | 上海专利商标事务所有限公司 31100 | 代理人： | 余颖 |
| 地址： | 瑞士科*** | 国省代码： | 瑞士;CH |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 岩藻糖 表达重组蛋白 宿主细胞 结合剂 细胞群 细胞 突变细胞 时间量 细胞膜 氨甲喋呤 导入基因 杀伤细胞 细胞亚群 突变 无毒 应用 | ||
1.一种选择用作表达重组蛋白宿主细胞的具有零岩藻糖水平的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)的方法，该方法包括：
(a)使含有至少一个具有突变GMD蛋白并具有零岩藻糖水平的CHO细胞的CHO细胞群接触无毒岩藻糖结合剂一定的时间量，使该岩藻糖结合剂结合于一个或多个细胞细胞膜上的岩藻糖部分，其中所述一定的时间量不会导致杀伤细胞；和
(b)清除含突变细胞的细胞群中结合该岩藻糖结合剂的一个或多个细胞的细胞亚群，从而选出用作表达重组蛋白的宿主细胞的细胞，所选细胞在无外源性岩藻糖条件下的岩藻糖含量为零，且具有如SEQ ID NO：23和/或24所示的突变的GMD，所述细胞表现出高于100群体倍增时间的稳定岩藻糖表型；
其中，所述含有至少一个具有突变GMD蛋白并具有零岩藻糖水平的CHO细胞的CHO细胞群是通过细胞与氨甲喋呤(MTX)接触获得的。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述CHO细胞选自CHO-K1、CHO-S、DUXB11、CHO-1E5、CHO3F、CHO/DG44和CHO-2.6。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述重组蛋白是抗体或Fc蛋白。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述岩藻糖结合剂附着于可检测部分或亲和部分。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述包含突变细胞的CHO细胞群与无毒岩藻糖结合剂接触的时间量不长于60分钟。
6.如权利要求4所述的方法，其中所述岩藻糖结合剂附着于亲和部分，所述方法进一步包括将所述突变的细胞群与其它物质接触，该其它物质含有与所述亲和部分同类的结合部分。
7.如权利要求4所述的方法，其中所述亲和部分包括生物素。
8.如权利要求6所述的方法，其中所述同类的结合部分附着于可检测部分。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述可检测部分包括荧光基团或磁性基团。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述清除通过FACS分拣来实施。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述清除通过磁性分离来实施。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述清除通过至少三轮顺次清除来实施。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述岩藻糖结合剂是橙黄网孢盘菌凝集素(AAL)或米曲霉菌1-岩藻糖特异性凝集素(AOL)。
14.一种生产重组蛋白的方法，包括：用包含编码重组蛋白的核酸序列的多核苷酸转染权利要求1中所述选出的CHO细胞；在适合于表达重组蛋白的条件下培养转染的CHO细胞；及分离蛋白。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述重组蛋白是抗体或Fc融合蛋白。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述转染在外源性岩藻糖存在下进行。
17.如权利要求14所述的方法，进一步包括将所述选出的CHO细胞在所述转染后于含岩藻糖的培养基中进行培养。
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