[发明专利]一种用于检测乙型流感病毒的RPA引物、探针、试剂盒及应用

权利要求书

1.一种用于检测乙型流感病毒的RPA引物，其特征在于，所述RPA引物核酸序列为：上游引物：B-F：5’-TCTGCTGGAATTGAAGGGTTTGAGCCATAC-3’，下游引物：B-R：5’-TCAAACGGAACTTCCCTTCTTTCTGAGTGT-3’。

2.一种用于检测乙型流感病毒RPA探针，其特征在于，所述RPA探针的核酸序列为SEQID NO.2：5’-GTTCCTCAAATAGCAACTGTCCGAAATACAATTGGACCGATTACCCTT-3’。

3.一种用于同时检测乙型流感病毒和甲型流感病毒的多重RPA引物和探针，其特征在于，包括权利要求1所述的引物和权利要求2所述的探针，还包括甲型流感病毒的RPA引物和探针。

4.根据权利要求3所述的一种用于同时检测乙型流感病毒和甲型流感病毒的多重RPA引物和探针，其特征在于，所述的甲型流感病毒的RPA引物核酸序列为：上游引物序列为：MF146：5’-GGCTCTCATGGAATGGCTAAAGACAAGAC-3’，下游引物序列为：MR425：5’-TTGTATATGAGGCCCATGCAACTGGCAAGTG-3’，所述的甲型流感病毒的探针序列为：SEQ ID NO.1：5’-TTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTG-3’。

5.含有权利要求1-4任一项权利要求所述的引物或探针的试剂盒。

6.一种检测乙型流感病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测病毒的RNA；

(2)RPA扩增：合成权利要求1和权利要求2所述的引物和探针，以提取待测样本的RNA为模板，进行逆转录反应，合成cDNA，而后采用乙型流感病毒RPA扩增体系扩增，RPA扩增采用权利要求1所述的引物和权利要求2所述的探针；

(3)分析上述扩增产物。

7.一种同时检测甲型和乙型流感病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测病毒的RNA；

(2)RPA扩增：合成权利要求4所述的用于检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的多重RPA引物和探针，以提取的待测样本的RNA为模板，进行逆转录反应，而后采用甲型和乙型流感病毒双重RPA扩增体系扩增，双重RPA扩增采用权利要求4所述的引物和探针，所述的甲型和乙型流感病毒探针的修饰物不同，所述的甲型和乙型流感病毒的探针的3’端分别标记有间臂Spacer(C3)，甲型流感病毒探针序列的32位置以及乙型流感病毒探针序列的33位置的胸腺嘧啶替换为四氢呋喃；

(3)分析上述扩增产物。

8.根据权利要求7所述的同时检测甲型和乙型流感病毒的方法，其特征在于，步骤(3)分析方法采用核酸免疫侧流层析试纸进行检测分析。

9.根据权利要求8所述的同时检测甲型和乙型流感病毒的方法，其特征在于，用于检测甲型和乙型流感病毒的RPA下游引物的5’端均标记有Biotin，用于检测甲型和乙型流感病毒的RPA探针的修饰物分别为FITC和DIG，核酸免疫侧流层析试纸上的两条检测线上分别喷涂Anti-FITC和Anti-DIG，核酸免疫侧流层析试纸上金标垫上喷涂有BSA，质控线上喷涂B-BSA。

10.根据权利要求9所述的同时检测甲型和乙型流感病毒的方法，其特征在于，核酸免疫侧流层析试纸上喷涂的Anti-FITC的浓度为至少为12.5ng/strip，Anti-DIG的浓度至少为75ng/strip，B-BSA的浓度至少为50ng/strip，核酸侧流层析时间至少为5分钟；双重RPA扩增的温度为35-45℃，双重RPA扩增的时间至少为5分钟，双重RPA扩增的所用的引物浓度分别为：甲型流感病毒RPA上下游引物终浓度各为50-200nM，乙型流感病毒RPA上下游引物终浓度各为50-200nM。