[发明专利]一种基于PMA染色的病菌定量检测方法

说明书

本发明一种基于PMA染色的病菌定量检测方法。所述方法包括：(1)将非可溶性固体植物样品剪成碎片，磨样处理后加入磷酸缓冲液，得到组织匀浆；(2)将匀浆分为A、B组，向A组加入PMA，同时向B组匀浆中加入相同体积的水；(3)将A、B两组分别依次进行PMA光交联处理、DNA提取、DNA模板定量、荧光定量PCR处理；(4)根据A、B组的Ct值，计算得出活病菌在总病菌中的所占比例。本方法可以用于判断植物病情，对病情进行分级；同时本发明能够检测植物组织内菌总量和活菌量，计算活菌在植物体内存活比例，提供一种用于判断病害防治方法和杀菌治疗方法的药效评价方法，为黄龙病病害防治提供一种药效及防治快速的评价方法。

技术领域

本发明涉及一种基于PMA染色的病菌定量检测方法，属于分析检测技术领域。

背景技术

黄龙病是柑橘(包括橘、柑、橙、柚、枳等)生产上危害最严重和最具破坏性的毁灭性病害。黄龙病被认为是由一种专生于柑橘韧皮部组织的细菌引起的，其传播途径包括嫁接和柑橘木虱传播。

目前所有已知的柑橘品种及柑橘近缘种都受到黄龙病病菌的浸染。感染病后的植株不仅不能产生经济价值，且易感程度高的品种如脐橙、葡萄柚等会在几年内逐渐衰亡，且目前尚无黄龙病治疗康复的相关报道。因此提供一种黄龙病病菌的快速、准确、定性和定量检测，对于黄龙病的防控和研究具有重要的意义。

目前针对黄龙病病菌的检测方法主要包括电镜检测、免疫学检测和PCR检测等手段。受柑橘寄主植株内黄龙病病原菌浓度低、不均匀分布及制样技术等因素限制，电镜观察检测的检出率一般在60％～70％之间，存在大量的漏检；免疫学检测特异性太强(申请号201210093995.1)，不同植株间无法混用；PCR诊断方法虽然在柑橘黄龙病检测上的应用已经实现了快速、准确、定性和定量的要求，被广泛用于黄龙病的实验室诊断；但目前PCR诊断技术是对黄龙病病菌的DNA量进行检测，由于菌死后在短期内仍有较多的DNA残留，PCR手段不能将植物体内的死菌、活菌区分出来。

此外，现有技术还公开了利用PMA进行死、活菌检测的技术内容，但检测对象须为菌液或其他液体形式，无法对非可溶性的复杂固体组织中活菌的菌含量进行定量检测。

发明内容

为了克服上述技术缺陷，本发明提供一种针对非可溶性固体植物组织中病菌含量的定量检测方法。该方法为黄龙病等植物病害的早期检测提供精准的定量分析，同时也为其防治提供准确的评价手段。

本发明的技术方案如下：

一种基于PMA染色的病菌定量检测方法，包括：

(1)将非可溶性固体植物样品剪成碎片，磨样处理后加入磷酸缓冲液(pH＝6.5)，得到组织匀浆；

(2)将匀浆分为A、B组，向A组加入PMA，同时向B组匀浆中加入相同体积的水；

(3)将A、B两组分别依次进行PMA光交联处理、DNA提取、DNA模板定量、荧光定量PCR处理；

(4)根据A、B组的Ct值，计算得出活病菌在总病菌中的所占比例。

下面对各步骤逐一进行说明。

步骤(1)中，所述非可溶性固体植物样品为植物组织，如叶片、茎秆、根系等，优选选取叶片，实际采样时，剪取叶脉中部，剪成1mm左右的碎片，备用。

步骤(1)中，所述磨样处理包括：

S1：对样品进行初次磨样、振荡，获得初样；其中，所述振荡的频率为20-30HZ，优选利用钢珠振荡磨样，频率为30HZ；

S2：向初样中加磷酸缓冲液(pH＝6.5)，再次磨样、振荡，形成悬浊液；

S3：将悬浊液过滤，得到粒径在0.25mm以下的组织匀浆；其中，悬浊液的过滤通常使用60目的纱网，去除其中的大颗粒。