[发明专利]薄壳山核桃品种Davis的特征序列、标记引物及鉴定方法

权利要求书

1.薄壳山核桃品种Davis的特征序列，其序列如下：5’-AATTCTGTTAGGAATTTCCTGAAAGCAGCCACAACATATTGGCAAGGATATTTCTATGCAAAATAGTTATTGTGTTAAAATAAGGTCTCCATTAGATCGTGCACAGTAAAGACAGTAATATCAAACTAAAGTATATATATATACACTATTTCTTTTCTTTTCCCTCACCTAATTCCTTCATACTAATTAACCACATTTACACTTTTATTTGAAGAACATTAAAAGGTTATAATATTATCAAAATTATATAATATTATACTCTTTTTAAGGGGTTGTTTAGATTCAGAAACCATCTTATCTTATTTTATCTCATCTCATTATTATAACTGTATCAAATTTTTATACAAAATATAATGACCACCTCGTACACATGTCTTCGAATTATCATGTTTTGTCATGT-3’ 。

2.薄壳山核桃品种Davis的分子特异性标记引物，所述引物序列如下：

上游引物：5′-TCCTGAAAGCAGCCACAACA-3′；

下游引物：5′- GACATGTGTACGAGGTGGTCA-3′。

3.一种利用权利要求2所述的分子特异性标记引物对薄壳山核桃品种Davis进行快速鉴定的方法，所述方法为：提取待测薄壳山核桃品种叶片的基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物8FDB行电泳检测，若电泳结果出现唯一359bp的特异DNA条带，则待测薄壳山核桃品种为薄壳山核桃品种为Davis，反之则否；所述分子特异性标记引物序列为：

上游引物：5′-TCCTGAAAGCAGCCACAACA-3′；

下游引物：5′- GACATGTGTACGAGGTGGTCA-3′。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述PCR扩增条件如下：94℃预变性300s后，95℃变性10s，56℃退火时间50s，72℃延伸40s，共循环30次，最后在72℃补平300s；终止温度为4℃。

5.如权利要求3，4所述的方法，其特征在于所述方法如下：

取待测薄壳山核桃叶片，加液氮磨碎，基因组DNA的提取采用bioteke新型快速植物基因组DNA提取试剂盒的操作说明；

以步骤（1）提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增：

PCR反应体系每15μl组成如下：

2×TsingKE master mix 7.5μl

10 μlM上、下游引物 各0.2μl

20 ng/μl模板DNA 2μl

dd H₂O 4.3μl；

PCR扩增条件如下：

94℃预变性300s后，95℃变性10s，56℃退火时间50s，72℃延伸40s，共循环30次，最后在72℃补平300s；终止温度为4℃；

取步骤（2）扩增产物3μl，与1μl 0.25%溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后EB染色，于自动凝胶成像系统上照相，若电泳结果出现唯一359bp的DNA条带，则待测薄壳山核桃品种为Davis，反之则否。