[发明专利]大肠杆菌O157:H7的CPA引物及试剂盒和检测方法

权利要求书

1.一种大肠杆菌O157:H7的CPA检测试剂盒，其特征在于包括CPA检测引物；

所述的CPA检测引物是针对靶点rfbE设计的，包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列分别如下所示：

靶点rfbE剥离引物4s：5’-aggaccgcagaggaaaga-3’(SEQ ID NO.1)；

靶点rfbE剥离引物5a：5’-tccacgccaaccaagatc-3’(SEQ ID NO.2)；

靶点rfbE交叉引物2a1s：5’-agtacattggcatcgtgtcagataaactcatcgaaaca-3’(SEQ IDNO.3)；

靶点rfbE特异引物2a：5’-agtacattggcatcgtgt-3’(SEQ ID NO.4)；

靶点rfbE特异引物3a：5’-ggcatcgtgtggacagggt-3’(SEQ ID NO.5)；

各CPA检测引物的浓度为10μM；

所述试剂盒还包括如下组分：

A、2×反应缓冲液：40.0mM的Tris-HCl，20.0mM的硫酸铵，20.0mM的氯化钾，16.0mM的硫酸镁，0.2％(v/v)的Tween 20，1.4M的甜菜碱，10.0mM的dNTPs；

B、Bst DNA聚合酶；

C、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液；

所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：

(1)提取待检样品的细菌DNA作为模板DNA，并控制模板DNA水溶液的OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.8～2.0；

(2)分别建立检测rfbE和/或stx1的交叉引物恒温扩增反应体系，于63℃水浴中保温至少60分钟进行交叉引物恒温扩增反应，待反应完成后于80℃水浴中保温2分钟终止反应；

(3)针对靶点rfbE的检测，终止反应后肉眼观察反应体系的颜色，如颜色为黄色，说明待检样品中不含有大肠杆菌O157:H7；如颜色变为绿色，说明待检样品中含有大肠杆菌O157:H7。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：组分B中所述的Bst DNA聚合酶是浓度为8U/μL的Bst DNA聚合酶水溶液。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：组分C中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液通过如下方法制备得到：

(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜中，配制50μM的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配制1mM的氯化锰水溶液；

(ii)取25μL 50μM的钙黄绿素溶液与10μL1 mM的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：步骤(2)所述的交叉引物恒温扩增反应体系为：2×反应缓冲液12.5μL，10μM的剥离引物4s和10μM的剥离引物5a各1.5μL，10μM的交叉引物2a1s 2.5μL，10μM的特异引物2a和10μM的特异引物3a各1.25μL，DNA模板1.0μL，8U/μL的Bst DNA聚合酶1.0μL，加去核酸水补足至25μL；最后加入1μL的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液。