[发明专利]适用于片状载体袋的CHO细胞生产分泌型蛋白的方法

权利要求书

1.适用于片状载体袋的CHO细胞生产分泌型蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)CHO细胞复苏

取CHO细胞冻存管于37-40℃水浴，融化后将CHO细胞悬液吸至装有生长液的方瓶内，待细胞汇合度达到80-90％后，扩大传代，转到方瓶中，其中分种比为1:2-3；

(2)片状载体袋中CHO细胞培养

将(1)中方瓶内细胞接种至装有培养基的片状载体袋，细胞接种密度为4E+5个/ml，然后将片状载体袋置于摆床中平衡过夜，其中，片状载体袋培养条件为温度37℃、PH7.2、溶解氧50％；摆床的摆床角度7°、速度30RPM；

(3)收集分泌蛋白

向(2)中的片状载体袋中连续灌流培养基，并补加7.5％NaHCO₃，同时收集上清液，每天收集上清液的体积为1-1.5个片状载体袋工作体积，连续收集25-30天，所得上清液即分泌蛋白；

(4)分泌蛋白纯化

将(3)所收集的上清液依次经过1um和0.45um滤芯过滤器过滤，然后将过滤后的上清液经纯化得到高纯度的分泌蛋白，再将所得的分泌蛋白进行超滤浓缩，得分泌蛋白原液；

其中，步骤(2)和步骤(3)中培养基为10％新生牛血清DMEM培养基。

2.根据权利要求1所述的适用于片状载体袋的CHO细胞生产分泌型蛋白的方法，其特征在于，步骤(4)中，纯化得高纯度的分泌蛋白的具体方法为：将过滤后的上清液依次经过亲和层析、分子筛层析、C4反相柱层析、超滤换盐和离子交换层析所得；

其中，亲和层析纯化条件具体为：采用Blue sepherose层析柱，用PBS缓冲液平衡柱4CV，流速30cm/h；上样体积20CV，以1.0mol/l NaCl、20mmol/LTris-HCl溶液洗脱收集蛋白；

分子筛层析纯化条件具体为：用100mmol/l NaCl、20mmol/L Tris-HCl 3CV平衡柱子，流速30cm/h，基线平稳后上样2.5mg/ml的收集蛋白；

C4反相柱层析纯化条件具体为：用20％乙醇、100mmol/l NaCl和20mmol/LTris-HCl平衡柱子，流速20cm/h，上样量4.0mg/ml，以20％乙醇、100mmol/l NaCl和20mmol/L Tris-HCl溶液洗涤；50％乙醇、100mmol/l NaCl和20mmol/L Tris-HCl溶液洗脱杂蛋白；65％乙醇、100mmol/l NaCl和20mmol/LTris-HCl溶液洗脱收集目的蛋白；

离子交换层析纯化条件具体为：用DEAE Sephrose6FF柱子，10mmol/LPH7.0 Tris-HCl溶液平衡洗涤柱子，20CV，流速100cm/h；用8CV 6mmol/l尿素，10mmol/l的PH＝3.9、4.1、4.3或4.5的甘氨酸的缓冲液洗脱杂蛋白，流速100cm/h；用200mmol/l NaCl、20mmol/L PH7.0Tris-HCl溶液、流速60cm/h，洗脱收集目的蛋白。

3.根据权利要求1所述的适用于片状载体袋的CHO细胞生产分泌型蛋白的方法，其特征在于，当步骤(1)中的CHO细胞为EPO二聚体融合蛋白CHO-BET细胞株时，步骤(3)中收集的分泌蛋白为EPO；当步骤(1)中的CHO细胞为TPO融合蛋白CHO细胞株时，步骤(3)中收集的分泌蛋白为TPO；当步骤(1)中的CHO细胞为改构天然TPA得到的CDNA片段CHO细胞株时，步骤(3)中收集的分泌蛋白为TPA。

4.根据权利要求1所述的适用于片状载体袋的CHO细胞生产分泌型蛋白的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述片状载体袋的规格为5L-1000L；所述片状载体袋中填充有片状载体，且片状载体的填充密度为5-50g/L。

5.根据权利要求1所述的适用于片状载体袋的CHO细胞生产分泌型蛋白的方法，其特征在于，步骤(2)中片状载体袋中细胞继续放大培养后，再进行步骤(3)的收集分泌蛋白；

细胞继续放大培养的具体步骤为：将步骤(2)中片状载体袋的细胞转入到比它规格大的片状载体袋中，接种细胞浓度3.2E+5个/mL，每天2次取样测糖；其中，摇床设置为：摇摆速度10rpm，温度37℃，摇床角度7°，溶解氧50％，PH7.2条件下培养4-5天后，再进行步骤(3)的收集分泌蛋白。