[发明专利]一种改良注射混合液制备及使用方法

说明书

本发明属于注射液技术领域，公开了一种改良注射混合液制备及使用方法。改良的注射混合液按比例由转染脂质体载体、外源质粒和外源miRNAs溶液组成；制备方法包括：将构建的外源质粒使用灭菌的ddH₂O稀释浓度为500ng/μL；其次将定制的miRNAs使用灭菌的ddH₂O稀释浓度为20pmoL/μL；然后准备转染脂质体载体；并按照转染脂质体载体：Sox9a外源质粒：外源miRNA(可为一种或多种混合物)＝2:1:1的比例配置混合液2～4μL。使用方法采用性腺体外显微注射结合电转染。本发明通过向原有的混合液中添加不同比例和不同种类的外源miRNAs，能够控制6个月斑马鱼精巢和卵巢的分化以及成鱼性腺再生。

技术领域

本发明属于注射液技术领域，尤其涉及一种改良注射混合液制备及使用方法。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：

过去十年之间，斑马鱼作为多种实验的载体已经成为一种具有很高研究价值的模型，斑马鱼在进化上更趋近于哺乳动物，和一些哺乳动物比如人类和小鼠具有同源基因。

斑马鱼类在性别分化的过程中展现出一定的可塑性，同时有着很强的调节机制。miRNAs和FSH/cAMP/MAPK/Sox9信号通路可以调节脊椎动物性腺的发育和性别分化，然而具体的调控网络不清晰，通过一种斑马鱼体外投影注射技术，可以通过外源注射基因对斑马鱼的性腺分化进行调控。

目前已知向6个月的雄性斑马鱼外源注射Sox9a外源基因只会增加精巢中精子的密度，减少精母细胞的数量。这种简单的注射方法存在了功能性单一，使用范围局限的缺点。促进性腺增生，特别是卵泡再生的报道不多。

综上所述，现有技术存在的问题是：

每次注射的外源基因单一，只能够向某个方向定向调控斑马鱼精巢的分化情况。

注射单种外源基因时，斑马鱼精巢分化的程度低，效果不显著。

还没有很好方法促进卵泡新生。

解决上述技术问题的意义：

本发明提供了一种能够在一定程度上控制斑马鱼性腺发育和分化的技术，为以后的鱼类或哺乳类性腺分化的科学研究提供了一种新的思路和方法。并且对成年鱼类繁殖问题提供了一个新的突破口，同时对人类不孕不育的问题也提供了治疗方向。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种改良注射混合液制备及使用方法。

本发明是这样实现的，一种改良注射混合液，所述改良注射混合液由转染脂质体载体、外源质粒和外源miRNAs溶液组成；

按质量比例转染脂质体载体：Sox9b外源质粒：外源miRNAs溶液＝＝2:1:1；

所述外源miRNAs溶液为外源miR141、外源miR-734、外源miR430a、外源miR218a中的一种或多种混合物。

进一步，Sox9a+miR430a组合促进精母细胞增生，将构建的外源质粒使用灭菌的ddH₂O稀释浓度为500ng/μL；再将定制的miRNAs使用灭菌的ddH₂O 稀释浓度为20pmoL/μL，按照质量比例转染脂质体载体：Sox9a外源质粒：外源miR430a＝2:1:1的比例配置改良注射混合液。

进一步，Sox9a+miR141+miR734组合促进类卵巢向精巢转化，将构建的外源质粒使用灭菌的ddH₂O稀释浓度为500ng/μL；其次将定制的miRNAs使用灭菌的ddH₂O稀释浓度为20pmoL/μL；按照质量比例转染脂质体载体：Sox9a 外源质粒：外源miR141：外源miR-734＝4:2:1:1的比例配置改良注射混合液。