[发明专利]脂肪来源间充质干细胞类外泌体的制备方法及应用

说明书

本发明提供一种脂肪来源间充质干细胞类外泌体的制备方法及应用。所述脂肪来源间充质干细胞类外泌体的制备方法，其特征在于，所述制备方法至少包括如下步骤：(1)将脂肪来源的间充质干细胞稀释后进行挤出，得到挤出液；(2)将所述挤出液置于梯度分离液中进行离心，无刹车降速，得到分层的混合液，所述分层的混合液包括上层组分、中间层组分和下层组分；(3)收集中间层组分，混入脂肪来源间充质干细胞外泌体，离心，所得沉淀即为脂肪来源间充质干细胞类外泌体。本发明的脂肪来源间充质干细胞类外泌体的制备方法制得的类外泌体，其制备量远高于传统外泌体；所述的类外泌体具有更好的肝脏疾病治疗效果。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种脂肪来源间充质干细胞类外泌体的制备方法及应用。

背景技术

随着干细胞治疗研究的进展，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)已在肝脏疾病治疗的基础研究和临床实验中均取得了肯定的疗效。MSCs的主要来源有骨髓、脐血、脂肪组织、滑膜等。我们从脂肪组织中也分离培养得到间充质干细胞(AMSC)，且其性质与骨髓来源的间充质干细胞相似，且脂肪中MSC频率是骨髓中含量的近100倍。脂肪组织来源丰富，供者不适度低，不受伦理限制，并且在体外经诱导可分化为肝细胞。我们已在多种肝脏疾病模型中证实脂肪组织来源的MSC(AMSC)具有肝病治疗作用，可有效缓解肝脏炎症，改善肝脏生化和病理指标，因此AMSCs具有极大的肝脏损伤的细胞治疗潜力。

但目前多数MSC的临床研究还处于临床I/II期阶段。究其原因，细胞制备周期长、费用高、不易保存、潜在成瘤风险、肺部毛细血管截留所致输注毒性等限制因素，导致了MSC临床应用发展缓慢。越来越多的研究显示，除分化为特定组织细胞外，MSC的疗效主要来源于其旁分泌作用。其分泌的细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)——微囊泡(microvesicles，MVs，直径0.1-1mm)和外泌体(exosomes，直径40-100nm)通过介导细胞间信号沟通和旁分泌因子传递而在MSCs的组织再生和免疫调控功能中发挥关键作用。MSCs来源的外泌体(MSCs-Exo)已在心血管、肾脏、肺部、神经系统等疾病治疗中表现出显著疗效。由于外泌体较之MSCs本身，其免疫原性更低，稳定性更好、保存方便，无输注毒性，因此MSCs-Exo在临床治疗应用中更具优势。

目前，MSCs-Exo已在包括肝纤维化、急性肝衰竭、药物性肝炎、自身免疫性肝炎等在内的多种肝病动物模型中显示出了令人鼓舞的疗效。不过虽然脂肪来源间充质干细胞外泌体AMSC-Exo在安全性及稳定性方面更具优势，但同等疗效下其需要量远超AMSCs移植量，达到较好疗效的单只小鼠的AMSC-Exo输注量需要小鼠近1/3的脂肪组织。虽然可以通过基因改造修饰等方式提高AMSC-Exo的疗效，但因涉及基因操作，所以其在临床应用上可能存在潜在的不确定因素。而传统的外泌体制备技术，包括超离、超滤、磁珠免疫、PEG沉淀法等，仍难以实现外泌体的大量制备。因此，其临床应用推广尚有赖于通过改进其制备技术，提升其制备量，而满足临床治疗剂量所需。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种脂肪来源间充质干细胞类外泌体的制备方法及应用。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种脂肪来源间充质干细胞类外泌体的制备方法，至少包括如下步骤：

(1)将脂肪来源的间充质干细胞稀释后进行挤出，得到挤出液；

(2)将所述挤出液置于梯度分离液中进行离心，无刹车降速，得到分层的混合液，所述分层的混合液包括上层组分、中间层组分和下层组分；

(3)收集中间层组分，混入脂肪来源间充质干细胞外泌体(AMSC-Exo)，离心，所得沉淀即为脂肪来源间充质干细胞类外泌体(AMSC-miExo)。

本发明第二方面提供一种脂肪来源间充质干细胞类外泌体，采用前述制备方法制成。