[发明专利]重组人蛋白激酶Nek2蛋白表达和纯化方法

权利要求书

1.重组人蛋白激酶Nek2蛋白的基因，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

2.重组人蛋白激酶Nek2蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述的重组人蛋白激酶Nek2蛋白的表达方法，其特征在于，包括

将人Nek2基因构建到原核表达载体pET30a(+)上，构建重组表达载体pET30a(+)-Nek2，并将所述的重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组工程菌株，将所述的重组工程菌株进行培养并加入诱导剂IPTG进行诱导表达重组人蛋白激酶Nek2蛋白，

所述的表达载体pET30a(+)上含有T7启动子和由6个组氨基酸组成的标签序列。

4.根据权利要求3所述的重组人蛋白激酶Nek2蛋白的表达方法，其特征在于，所述的重组人Nek2蛋白的目的基因序列为Nek2全长序列，利用PCR技术从人HL7702细胞中克隆Nek2全长cDNA，以此cDNA为模板进行PCR扩增，其上游引物F(B)如序列表SEQ ID NO.3所示：AAAGGATCCATGCCTTCCCGGGCTGAGGACTAT(划线部分为Bam HⅠ酶切位点)，下游引物R(Sa1Ⅰ)如序列表SEQ ID NO.4所示：AAAGTCGACCTAGCGCATGCCCAGGATCTGT(划线部分为Sa1Ⅰ酶切位点)。

5.根据权利要求3所述的重组人蛋白激酶Nek2蛋白的表达方法，其特征在于，所述的构建原核表达载体的方法为：利用PCR技术从人HL7702细胞中克隆Nek2全长cDNA，以此cDNA为模板进行PCR扩增得到的PCR扩增产物与表达载体pET30a(+)分别用Bam HⅠ和Sa1Ⅰ酶进行双酶切，酶切产物经DNA纯化试剂盒纯化，然后将纯化产物用T4Ligase连接，构建重组表达载体pET30a(+)-Nek2。

6.根据权利要求3所述的重组人蛋白激酶Nek2蛋白的表达方法，其特征在于，所述的重组基因工程菌株为BL21-pET30a(+)-Nek2。

7.根据权利要求3所述的重组人蛋白激酶Nek2蛋白的表达方法，其特征在于，诱导Nek2蛋白表达的条件为：37℃，200rpm条件下培养约2.5-3h至对数生长期，加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导8h，诱导表达的重组人蛋白激酶Nek2蛋白为包涵体蛋白。

8.根据权利要求3所述的重组人蛋白激酶Nek2蛋白的表达方法，其特征在于，诱导表达的重组人Nek2蛋白的纯化方法为：超声破碎菌体，离心后沉淀重悬于Binding Buffer中；再次离心，将上清液负载到Ni琼脂糖凝胶层析柱中4℃摇床过夜，先用Binding Buffer冲洗柱子，再用含150mM咪唑浓度的Elution Buffer洗脱，收集洗脱液；将洗脱液过10KDA超滤管浓缩后跑SDS-PAGE电泳进行250mM KCl染色切胶回收。

9.根据权利要求8所述的重组人蛋白激酶Nek2蛋白的表达方法，其特征在于，

诱导表达的重组人蛋白激酶Nek2蛋白的纯化方法，所述的Binding Buffer组成为：20mM Tris-HCI，pH 7.9，500mM NaCl，5mM咪唑，8M尿素；Elution Buffer组成为：20mMTris-HCI，pH 7.9，500mM NaCl，150mM咪唑，8M尿素。

10.根据权利要求8所述诱导表达的重组人Nek2蛋白纯化得到的重组人蛋白激酶Nek2纯化蛋白在制备单克隆抗体中的应用。