[发明专利]一种富硒米曲霉的分离筛选方法及其应用

权利要求书

1.一种富硒米曲霉的分离筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1，米曲霉菌株的活化：将米曲霉菌株接种到察氏斜面培养基上，30-40℃培养3-5d，得到培养物，传代1-5次，储存于0-4℃备用；

S2，单孢子悬浮液的制备：取经活化过的米曲霉菌株斜面一支，清洗，过滤，得到单孢子悬浮液，于150-200r/min摇床震荡1-2h；

S3，富硒米曲霉菌株的初筛：取米曲霉单孢子悬浮液涂布在察氏平板培养基上，选择保存；

S4，富硒米曲霉菌株的复筛：取初筛保存的米曲霉斜面一支，挑取一环孢子，接种到种子培养基中，置于150-200r/min的37-40℃的摇床上培养48-72h；配制硒的质量百分浓度为40-100μg/ml的YEPD培养基，按体积比为5-10％的接种量接种初筛的菌株，37-40℃培养48-72h。

2.如权利要求1所述的一种富硒米曲霉的分离筛选方法，其特征在于：所述步骤S1中，米曲霉菌株为米曲霉ZLA16、米曲霉ZLB35、米曲霉ZLC06、米曲霉ZLD14、米曲霉ZLE09和米曲霉ZLF13中的任意一种。

3.如权利要求1所述的一种富硒米曲霉的分离筛选方法，其特征在于：所述步骤S1中，察氏斜面培养基的配方包括以下质量份数：硝酸钠1-3份，磷酸二氢钾0.5-1份，硫酸镁0.1-0.5份，氯化钾0.1-0.5份，硫酸亚铁0.01-0.05份，蔗糖10-50份，琼脂10-30份，pH为6-8，121℃灭菌30-45min。

4.如权利要求3所述的一种富硒米曲霉的分离筛选方法，其特征在于：所述步骤S1中，察氏斜面培养基的配方包括以下质量份数：硝酸钠2份，磷酸二氢钾0.8份，硫酸镁0.3份，氯化钾0.3份，硫酸亚铁0.25份，蔗糖30份，琼脂20份，pH为7，121℃灭菌40min。

5.如权利要求1所述的一种富硒米曲霉的分离筛选方法，其特征在于：所述步骤S2中，用无菌生理盐水清洗3-5次；用3-5层纱布过滤；将单孢子悬浮液置于装有无菌玻璃珠的三角瓶中；于180r/min摇床震荡1.5h。

6.如权利要求1所述的一种富硒米曲霉的分离筛选方法，其特征在于：所述步骤S3中，取米曲霉单孢子悬浮液0.1-0.5ml涂布在硒的质量百分浓度为100-200μg/ml的察氏平板培养基上，37-40℃避光培养48-72h，选择周围有红色硒单质出现的菌落，将其分别接种到察氏斜面培养基保存。

7.如权利要求6所述的一种富硒米曲霉的分离筛选方法，其特征在于：所述步骤S3中，察氏平板培养基是在察氏斜面培养基中添加亚硒酸钠至硒浓度为100-200μg/ml，加水定容至1L，121℃灭菌30-45min。

8.如权利要求1所述的一种富硒米曲霉的分离筛选方法，其特征在于：所述步骤S4中，种子培养基的配方包括以下质量份数：豆芽10-50份煮成汁，可溶性淀粉10-30份，磷酸二氢钾0.5-2份，硫酸铵0.1-1份，硫酸镁0.1-1份，pH为6-8，121℃灭菌30-45min。

9.如权利要求1所述的一种富硒米曲霉的分离筛选方法，其特征在于：所述步骤S4中，YEPD培养基的配方包括以下质量份数：葡萄糖10-30份，酵母膏10-30份，硫酸铵1-10份，磷酸二氢钾0.5-2份，氯化钙0.5-2份，硫酸镁0.1-1份，维生素B10.01-0.02份，添加亚硒酸钠至硒的质量百分浓度为40-100μg/ml，121℃灭菌30-45min。

10.如权利要求1～9任一项所述的一种富硒米曲霉的分离筛选方法的应用，其特征在于：所述富硒米曲霉添加在饲料、食品和营养品中。