[发明专利]一株以甘油为底物生产丁二酸的重组菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一株以甘油为底物生产丁二酸的重组菌及其构建方法与应用。本发明为了减少杂质的生成并提高丁二酸的产量，在大肠杆菌中引入了Ⅱ型甘油代谢系统，通过对重组菌Suc‑T11进行分子改造，构建了在厌氧条件下工作的电子传递链，提高了能量的供应能力，进而提高了丁二酸产量。实验证明：本发明构建的重组菌YY‑GS004在批式发酵中，丁二酸产量达到了482.5mM，是其亲本的3.82倍，转化率达到了0.92mol_丁二酸/mol_甘油，达到理论值的92％，接近理论转化率；在好氧‑厌氧两步法的补料发酵中，丁二酸的产量达到了565.3mM。本发明构建得到的重组菌在丁二酸生产中具有重大意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株以甘油为底物生产丁二酸的重组菌及其构建方法与应用。

背景技术

丁二酸是一种重要的有机化工原料，广泛应用于农业、食品、药品工业中，是美国能源部认定的12种最具价值的大宗化学品之一。作为一种优秀的C4平台化合物，丁二酸可以用于合成环保溶剂、药剂制品和可降解塑料等多种化工产品。传统的生产丁二酸的方法是以顺丁烯二酸酐为底物通过石化法来生产，但石油价格波动、环境污染大、生产工艺复杂、生产成本高，导致丁二酸的应用受到严重限制。利用微生物发酵生产丁二酸，具有成本低、污染小、环境友好的优势，因此开发高效的生物法生产丁二酸策略具有十分重要的经济和环境效益。

到目前为止，科学家们已经构建出了许多能够高效生产丁二酸的菌株，例如经过基因工程改造的大肠杆菌Escherichia coli(Tan Z,Zhu X,Chen J,et al.Activatingphosphoenolpyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase incombination for improvement of succinate production[J].AppliedEnvironmentalMicrobiology,2013,79(16):4838-4844.)和曼海姆产琥珀酸菌Mannheimiasucciniciproducens(Ahn JH,Jang YS,Sang YL.Production of succinic acid bymetabolically engineered microorganisms[J].Current Opinion in Biotechnology,2016,42:54-66.)，但这些菌都是以葡萄糖为碳源进行琥珀酸的发酵生产。

甘油是一种在生物柴油生产过程中产生的副产物，每生产9吨生物柴油就会产生约1吨的粗甘油。随着生物柴油产量的不断增加，副产物甘油的产量也迅速增加，由于生产生物柴油时产生的粗甘油中含有盐类、甲醇、皂等杂质，所以必须精制后才能利用，但其精制成本高，在经济上并不可行。如何对副产物粗甘油进行开发利用，已成为生物柴油产业可持续发展的关键和保障。如果可以将副产物甘油通过发酵生产转化为高附加值的丁二酸，就能有效降低生物柴油的生产成本，同时也能降低丁二酸的生产成本，提升生物柴油的整体技术水平和效益。