[发明专利]一种重度免疫缺陷猪模型及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种重度免疫缺陷猪模型及其构建方法和应用，所述方法利用BE3点突变工具敲除RAG1、RAG2和IL2RG基因获得免疫缺陷猪模型；本发明通过C变T点突变工具获得多基因敲除的免疫缺陷猪模型，安全性更好，免疫缺陷程度更高，完全缺失T细胞、B细胞和NK细胞，更利于后续的应用研究，构建方法简洁高效，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种重度免疫缺陷猪模型及其构建方法和应用。

背景技术

免疫缺陷小鼠在生物医药与基础研究领域发挥了重要的作用，但是由于小鼠与人之间的差异较大，在小鼠上经常会获得一些假阳性或假阴性的实验结果，严重限制了免疫缺陷小鼠的应用。而猪相较于小鼠与人有更多的相似性，包括体型大小、生理代谢水平和免疫系统等，因此建立免疫缺陷猪模型就具有更重要的现实意义。

目前，免疫缺陷猪模型主要有以下几种：(1)利用基因打靶载体敲除IL2RG基因获得免疫缺陷猪，该模型表现为T细胞NK细胞缺失，B细胞功能异常；(2)利用TALENs敲除RAG1/2基因，该模型表现为T细胞B细胞缺失，NK细胞正常；(3)利用CRISPR/CSA9技术敲除RAG2和IL2RG基因，克隆猪表现为T细胞B细胞和NK细胞缺失。但是这些基因打靶方法基因敲除效率较低，同时CRISPR/CAS9具有一定的脱靶风险，很难更高效率更安全的获得多基因敲除的免疫缺陷猪模型。单一基因敲除免疫缺陷猪模型存在B细胞或者NK细胞，免疫缺陷程度不能达到后续实验应用的要求，利用CRISPR/CAS9可以获得多基因敲除模型，但是CRISPR/CAS9的脱靶问题依旧存在，可能会对克隆猪产生不可预料的风险。

BE3点突变工具可以实现胞嘧啶到胸腺嘧啶的转变，该基因编辑工具在nCSA9基础上连接脱氨酶APOBEC1，使其能高效靶向目的基因的同时不产生双链断裂，具有更高的安全性。目前为止，未见有利用BE3点突变工具敲除相关基因获得免疫缺陷猪的报道。

因此，提供一种用BE3点突变工具构建的免疫缺陷猪模型，提高安全性和效率，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种重度免疫缺陷猪模型及其构建方法和应用，所述方法利用BE3点突变工具敲除RAG1、RAG2和IL2RG基因获得免疫缺陷猪模型，构建方法简洁高效，安全性更好，免疫缺陷程度更高，完全缺失T细胞、B细胞和NK细胞，更利于后续的应用研究。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种重度免疫缺陷猪模型的构建方法，所述方法利用BE3(rAPOBEC1-nCas9-UGI，Cas9变体(nCas9)融合大鼠胞嘧啶脱氨酶(rAPOBEC1)和尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI))点突变工具敲除RAG1、RAG2和IL2RG基因获得免疫缺陷猪模型。

优选地，所述方法包括如下步骤：

(1)根据猪的RAG1、RAG2和IL2RG基因序列，筛选gRNA位点；

(2)将步骤(1)的gRNA连接至载体上，得到重组质粒；

(3)将BE3质粒和步骤(2)的重组质粒转染细胞，筛选单细胞克隆；

(4)将筛选的单克隆细胞的体细胞核与去核卵母细胞融合，移植到代孕母猪体内，鉴定得到重度免疫缺陷猪模型。

在制备重度免疫缺陷猪模型的过程中，存在以下问题：1.单一基因敲除免疫缺陷猪模型的免疫程度不高；2.利用CRISPR/Cas9进行多基因修饰会引起严重的基因组损伤，降低克隆动物出生效率；3.CRISPR/CAS9的脱靶问题依旧存在，可能会对克隆猪产生不可预料的风险的难题。