[发明专利]发根农杆菌介导的桃根系稳定转化方法及其应用

权利要求书

1.一种发根农杆菌介导的桃根系稳定转化方法，其特征在于：

①无菌实生苗培养

A、收集以枣油桃7成熟果实，去除果肉，用20％的商业化漂白剂浸泡30min后，去除漂白剂，风干桃核，4℃保存2个月；

B、4℃取出桃核，去除内果皮，在超净台上，将枣油桃种子置于烧杯中，用75％的酒精消毒种子30s和20％商业化漂白剂附加0.02％Tween-20混合消毒液搅拌器浸泡25min后，无菌水润洗6-8次，将种子置于新的装有ddH₂O的无菌瓶中过夜；

C、在超净台上，用无菌刀片去除种皮，将种子接种在1/2MS+0.05mg/LIBA+0.5mg/L 6-BA发芽培养基，培养基pH 5.8，25+1℃，黑暗条件培养15d；实生苗茎段长10cm后，移至25+1℃，16h光照，8h黑暗的光周期条件下生长10d，叶片完全舒展和变绿；

②转化受体材料外植体制备

将约1.5cm长的芽段外植体从无菌苗上切割下来作为转化用的受体材料，切口斜切，以增加菌与伤口的接触面积；

③侵染菌液制备

使用的转基因菌株是携带红色荧光蛋白基因35S：：DsRED1表达盒的MSU440发根农杆菌菌株；从-80℃冰箱取出保存在甘油中的MSU440转基因菌，于LB固体培养基附加50mg/L壮观霉素的培养皿上划线，28℃暗处倒置培养36-48h获得单菌落；挑取单菌落于100mL LB液体培养基附加50mg/L壮观霉素的无菌培养瓶中，200rpm，28℃振荡培养至菌液浓度是OD₆₀₀0.8，4000rpm/5min离心菌液，除去上清液，剩下的菌用适量体积的重悬液MS+2％蔗糖+20mg/L AS重悬培养1.5-2h后，作为待用侵染液，待用侵染液浓度是OD₆₀₀ 0.8；

④侵染

用含有35S：：DsRED1表达盒的MSU440发根农杆菌重悬液OD₆₀₀ 0.8侵染有伤口的外植体30min；

⑤共培养：

用无菌滤纸吸干芽段外植体上的菌液，然后接种在MS+3％蔗糖+0.8％琼脂+20mg/L AS共培养基，25+1℃，黑暗条件共培养3d；

⑥转基因根诱导培养

用400mg/L头孢润洗液润洗共培养3d的芽段外植体3-5次，然后置于无菌滤纸吸干水后，将接种在MS+3％蔗糖+0.8％琼脂+400mg/L头孢+50mg/l壮观霉素的诱导培养基，25+1℃，黑暗条件培养诱导转基因毛状根发生；

⑦转基因根检测

待根发出后，在体视荧光显微镜下观察MSU440发根农杆菌诱导获得的毛状根激发的红色荧光蛋白信号，初步确定其转基因根，PCR实验对其再进行确定为转基因根；

⑧复合型桃植株获得

将含有转基因根的复合型植株在16h光照，8h黑暗光周期，25+1℃条件，水培1周后栽培到含营养元素的土壤中生长以获得含转基因根的复合型桃植株。