[发明专利]一种提高种公猪精子活力激动剂的制备方法

权利要求书

1.一种提高种公猪精子活力激动剂的制备方法，其特征包括以下步骤：

(1)取出小公猪睾丸组织，放入加有1％双抗的37℃生理盐水中浸润10～30min；

(2)取出浸润后的公猪睾丸组织，用含有1％双抗的PBS缓冲液清洗三遍；

(3)加入DMEM/F12细胞培养液，37℃下培养30min，充分分解睾丸组织，将分散后的组织液转移至离心管中，离心去上清液；

(4)在离心管中加入1.5mL透明质酸酶和1.5mL胶原酶IV，在37℃下，每隔2分钟剧烈震荡一次，连续震荡2～3次后，加入3mL的DMEM/F12细胞培养液，离心去上清液；

(5)在离心管中加入1.5mL胰蛋白酶和1.5mL脱氧核糖核酸酶，在37℃下，每隔2分钟剧烈震荡一次，连续震荡2～3次后，加入3mL的DMEM/F12细胞培养液；

(6)将细胞液依次用80、200、300目的细胞筛过滤；

(7)将过滤后的细胞培养液离心去上清液，加入4～6mL的细胞培养液，吹打混匀，转到细胞培养皿中培养2小时后更换新的细胞培养液；

(8)将培养皿中的细胞培养传代，传代后，每个直径为6cm的细胞培养皿接种1×10⁶个细胞；

(9)将细胞液培养8小时后取出，放到-20℃冷冻保存，即得。

2.根据权利要求1所述的提高种公猪精子活力激动剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)的具体操作为：将小公猪进行麻醉，对小公猪进行去势操作，摘出睾丸，手术剪除去血液和脂肪组织，将睾丸剪碎，把剪碎后的睾丸组织加入含有1％双抗的生理盐水中，在37℃、5％CO₂培养箱内孵育10～30min。

3.根据权利要求2所述的提高种公猪精子活力激动剂的制备方法，其特征在于：所述小公猪指出生后7～10日龄内的小公猪。

4.根据权利要求1所述的提高种公猪精子活力激动剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)、(2)中双抗为含有青霉素(10000IU)和链霉素(10000μg/mL)在100倍的工作浓度的混合液。

5.根据权利要求1所述的提高种公猪精子活力激动剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)、(4)中DMEM/F12细胞培养液，是由F12培养基和DMEM培养基以1∶1比例混合均匀制成，适于克隆密度的培养。

6.根据权利要求1所述的提高种公猪精子活力激动剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(7)中细胞培养液为RPMI-1640型细胞培养液。

7.根据权利要求1所述的提高种公猪精子活力激动剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(8)中，细胞接种浓度为1×10⁶个/直径为6cm的细胞培养皿。