[发明专利]兼具激活免疫共刺激信号通路和阻断免疫检查点的复制型溶瘤腺病毒及其应用

权利要求书

1.一种兼具激活免疫共刺激信号通路和阻断免疫检查点的复制型溶瘤腺病毒，其特征在于：所述的复制型溶瘤腺病毒在肿瘤细胞内复制，并且表达和分泌可溶性融合蛋白，所述的可溶性融合蛋白的两端分别为结合PD-L1的PD1和结合CD137的CD137L，PD1和CD137L之间通过linker序列连接，所述的可溶性融合蛋白为sPD1CD137L，sPD1CD137L的蛋白序列的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

2.如权利要求1所述的兼具激活免疫共刺激信号通路和阻断免疫检查点的复制型溶瘤腺病毒在制备活化抗肿瘤免疫药物中的应用。

3.如权利要求1所述的兼具激活免疫共刺激信号通路和阻断免疫检查点的复制型溶瘤腺病毒在制备刺激IFN-γ表达药物中的应用。

4.如权利要求1所述的兼具激活免疫共刺激信号通路和阻断免疫检查点的复制型溶瘤腺病毒在制备抗肿瘤药物中的应用。

5.如权利要求4所述的兼具激活免疫共刺激信号通路和阻断免疫检查点的复制型溶瘤腺病毒在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的肿瘤为肝癌、腹水癌、黑色素瘤或乳腺癌。

6.一种兼具激活免疫共刺激信号通路和阻断免疫检查点的复制型溶瘤腺病毒AD5sPD1CD137L的构建方法，其特征在于包括如下步骤：(1)AD5sPD1CD137L全长质粒构建：将构建好的穿梭载体AD5-pShuttlesPD1-CD137L用PmeI线性化后转入感受态pAdEasy-BJ5183中，使用含50ug/ml卡那霉素LB平板的进行筛选，挑取阳性克隆培养鉴定，鉴定正确的克隆质粒重新转化DH5a感受态进行二次筛选鉴定，鉴定正确后进行质粒大提获得AD5sPD1CD137L全长质粒；sPD1CD137L的蛋白序列的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；(2)AD5sPD1CD137L病毒拯救：AD5sPD1CD137L全长质粒使用PacI线性化，纯化后6孔板中1ug/well转染293T细胞，5％CO2、37℃培养，2天后将细胞消化后转入10cm平皿，2-3天换液，至80％细胞出现病变，使用10ml培养基将细胞吹下收集至15ml离心管，反复冻融2次，3000rpm/min离心15min，收集病毒上清-80℃保存做为毒种；(3)病毒扩增：取病毒种液50ul加入60％293T细胞10cm平皿中，5％CO2 37℃培养，细胞密度至90％以上，按照1传3比例传代，直至80％细胞出现病变，有10个平皿细胞，按上述方法收病毒，使用氯化铯密度梯度离心纯化病毒；使用TCID50方法进行滴度测定。