[发明专利]一种特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针，其特征在于，所述蛋白荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；该蛋白荧光探针是基于绿色荧光蛋白roGFP基因定点突变而得，所述定点突变是将roGFP氨基酸序列中第202位的丝氨酸突变为半胱氨酸，第204位的半胱氨酸突变为丝氨酸。

2.权利要求1所述的特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(1)以绿色荧光蛋白基因为模板，定点突变构建得蛋白荧光探针的基因序列，去掉起始密码子atg后插入到表达载体pET30的多克隆位点上，获得N端带有6-his标签的蛋白荧光探针的表达载体pET30-psGFP；所述蛋白荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)将步骤(1)获得的表达载体pET30-psGFP转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组表达大肠杆菌；

(3)将步骤(2)获得的重组表达大肠杆菌进行培养，IPTG诱导表达蛋白荧光探针，并对重组表达大肠杆菌细胞进行裂解，利用his标签进行蛋白纯化，即得特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述绿色荧光蛋白为roGFP，所述定点突变是将roGFP氨基酸序列中第202位的丝氨酸突变为半胱氨酸，第204位的半胱氨酸突变为丝氨酸。

4.权利要求1所述的特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针在检测体外多硫化物中的应用，方法如下：

将权利要求1所述的特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针与二巯基苏糖醇完全反应，脱盐后得还原态蛋白荧光探针，将还原态蛋白荧光探针与多硫化物样品混合反应后脱盐，采用荧光分光光度计对反应液中蛋白荧光探针的荧光强度进行扫描，激发光谱Ex分别设定为408nm和488nm，发射光谱Em设定为510nm，记录两个不同激发光谱的Em510数据，并计算Ex为408nm时Em510和Ex为488nm时Em510的比值，比值越高，说明多硫化物的浓度越高。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述方法包括以下条件中的一项或多项：

1)所述脱盐采用脱盐柱脱盐；

2)所述混合反应的条件为冰浴反应30-50min；

3)所述多硫化物样品为H₂S_n或谷胱甘肽过硫化物；

4)所述多硫化物样品的检测浓度的10-170μM，所述反应液中蛋白荧光探针的工作浓度为0.01-0.1mg/mL。

6.权利要求1所述的特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针在检测酿酒酵母体内多硫化物中的应用。