[发明专利]一种检测细胞内pH的比率型荧光探针及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种检测细胞内pH的比率型荧光探针及其制备方法和应用。该荧光探针的化学结构式为：。可通过4‑氰基苯硼酸与5‑溴水杨醛的反应产物在进一步与邻氨基苯硫酚反应获得。本发明的荧光探针具有高特异性，在进行相应pH检测过程中不受其他组分的干扰，可用于活细胞内pH的实时测定。该探针的灵敏度高，具有良好的荧光发射光谱特性（415‑700 nm），通过绘制标准曲线进行细胞内pH的测定，可以实现对细胞内pH快速准确检测的目的。本发明提供的荧光探针合成方法，工艺简单易行，原料廉价易得，制备成本低，易于推广。本探针在生物监测领域具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种检测细胞内pH的比率型荧光探针及其应用。

背景技术

pH值作为细胞内新陈代谢的重要参数之一，在维持细胞生长、增殖、凋亡及信号传导等正常生理过程中起着关键性作用。除此之外，细胞的内吞、吞噬及受体配体的内化作用等内化通路也会受到pH的影响。正常生物体内体液酸碱度(pH值)总是稳定在一定范围之内，人体最佳pH呈弱碱性，为7.35-7.45，当其发生上下波动时可能会导致细胞功能发生障碍，严重的可以危机生命安全。若pH低于正常值，细胞呈酸性会抑制酶及激素活性，降低组织功能，也会使人体免疫力下降，红细胞及血小板易发生聚集。同事，酸性细胞环境不利于钙吸收，造成骨质疏松，而且也有研究表明细胞pH环境处于6.2-6.9范围内会使得其癌变的几率大大增加。若pH值偏高会发生碱中毒，酸碱平衡紊乱也会对人体某些器官造成不可逆损伤。

目前，可用于检测细胞内pH值的方法包括³¹P核磁共振法，微电极法，吸收光谱法等，但这些方法存在机械损伤、价格昂贵，难以精确测量等缺点。而荧光光谱法则是利用荧光参数如荧光强度、荧光寿命等变化对pH值进行测定，灵敏度高，选择性好，响应速度快等优点，更重要的是能够实时原位监测细胞内pH的变化而成为目前广泛采用的检测细胞内pH的一种重要方法。

发明内容

针对现有技术中的问题，本发明提供一种检测pH的比率型荧光探针，监测范围广，抗干扰能力强。

本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针在检测溶液中或生物细胞内pH的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种检测pH的比率型荧光探针，其化学结构式如式（I）所示：

式（I）。

上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

（1）将4-氰基苯硼酸，5-溴水杨醛，Pd(dppf)Cl₂（[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯），醋酸钾溶于1,4-二氧六环，在氮气保护下加热搅拌至反应充分，将反应液冷却至室温，过滤除去固体杂质，滤液分离纯化得到浅黄色化合物1：

；

（2）化合物1，邻氨基苯硫酚在对甲基苯磺酸存在下于二甲基甲酰胺中加热搅拌反应；反应完成后，将反应液在0℃左右迅速冷却，后向反应液中加入水，得到黄色固体沉淀，分离沉淀并纯化得到化合物2，即荧光探针：

。

步骤（1）中，4-氰基苯硼酸与5-溴水杨醛的摩尔比为0.8-1:1-1.5。

步骤（2）中，化合物1与邻氨基苯硫酚的摩尔比为1:1-1.5。

步骤（1）中，分离纯化过程为：以石油醚：乙酸乙酯体积比为5:1的淋洗液，将滤液通过柱层析（石油醚：乙酸乙酯=5:1）。

步骤（2）中，纯化过程为：以石油醚：乙酸乙酯体积比为5:1的淋洗液，将沉淀通过柱层析得到探针。

一种上述荧光探针在检测溶液、细胞或生物体中pH的应用。