[发明专利]一种抗手足口病鸡卵黄抗体的制备方法

说明书

本发明的目的是针对上述手足口病病毒感染难以预防和治疗的问题，提供一种抗手足口病鸡卵黄抗体的制备方法，一种抗手足口病鸡卵黄抗体的制备方法，包含以下步骤：1)制备手足口病病毒EV71病毒颗粒；2)根据EV71序列设计一对特异性引物，表达VP1蛋白；3)复合抗原的制备；4)将复合免疫抗原对SPF产蛋母鸡进行免疫，获得免疫鸡蛋；5)将免疫鸡蛋蛋黄进行提取、纯化，后过滤除菌，再经过超低温喷雾干燥，即得抗体纯品，4℃保存，本发明所制备的鸡卵黄抗体，具有安全方便、简单易得、产率高、成本低、特异性强。

技术领域

本发明涉及免疫学技术领域，特别是指一种抗手足口病鸡卵黄抗体的制备方法。

背景技术

手足口病(Hand foot and mouth disease HFMD)是一种儿童传染病，又名发疹性水疱口腔炎，是由一组肠道病毒引起的常见传染病，该病全年均可发病，多发于夏秋季，可引起发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹，具有很强的传染性，可以通过玩具、食具、鼻咽分泌物、飞沫粪便等多种途径传染。手足口病的易感人群基本是五岁以下儿童，临床表现以发热和手、足、口腔等部位的疱疹为主要临床特征，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等，合并神经系统、呼吸系统、循环系统等并发症状，导致严重的后遗症甚至死亡，尤以脑干脑炎为甚。严重威胁儿童健康。2008年我国首次将手足口病纳入法定传染病。

手足口病是由肠道病毒引起的传染病，引发手足口病的肠道病毒有20多种(型)，其中以肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(Cox A16)最为常见，不同年间的主要感染病毒类型有所变化。手足口病病例中，EV71型感染引发的后遗症更严重，致死率更高，在我国EV71-C4亚型占主导地位。中国疾病预防控制中心统计数据显示，2008-2015年，我国共报告手足口病约1380万例，平均年发病率为14.7例/万人，重症病例约13万例，死亡3300多人。其中EV71、CV-A16和其他肠道病毒感染比例分别为44％、25％和31％。重症病例中EV71感染占74％，死亡病例中EV71构成比高达93％，据估算，我国每年由EV71感染所致重症和轻症手足口病病例的费用分别为1.8亿元和10亿-20亿元。

HFMD病病人可以通过呼吸道分泌物、疱疹液和粪便排泄病毒，该病主要侵犯5岁以下儿童。儿童个人卫生行为难以控制，隔离也比较困难，并且隐性传播比例高，易造成大规模传染，这给手足口病的预防带来了困难。因此，研制一种能够特异性中和EV71和CA16病毒、抑制其感染的抗体产品，将能有效阻断病毒的传播，快速提高机体免疫力，恢复机体健康，对于防控和减少手足口病的发生具有重大意义，同时也具有广阔的市场前景。

发明内容

本发明的目的是针对上述手足口病病毒感染难以预防和治疗的问题，提供一种抗手足口病鸡卵黄抗体的制备方法。

本发明的技术方案是这样实现的：一种抗手足口病鸡卵黄抗体的制备方法，包含以下步骤：

1)制备手足口病病毒EV71病毒颗粒；

2)根据EV71序列设计一对特异性引物，以手足口患儿咽拭子标本提取病毒核酸经逆转录后产物(cDNA)为模板，PCR扩增VP1基因(反应条件：95℃，5min；(95℃，30sec；55℃，30sec；72℃,90sec)×30；72℃，10min)，再经PCR扩增后双酶切的方法构建原核表达载体pET22b-VP1，测序成功后的表达载体用于VP1蛋白的表达；

3)复合抗原的制备；

4)将复合免疫抗原对SPF产蛋母鸡进行免疫，获得免疫鸡蛋；

5)将免疫鸡蛋蛋黄进行提取、纯化，后过滤除菌，再经过超低温喷雾干燥，即得抗手足口病的鸡卵黄抗体纯品，4℃保存。

优选的，步骤2)中一对特异性引物的序列，上游引物：GGAGATAGGGTGGCAGATGTAA，下游引物：AAGAGTAGTGATCGCTGTGCGA。