[发明专利]一种携带功能基团O-糖链的制备方法

说明书

本发明具体涉及一种携带功能基团O‑糖链的制备方法，以全乙酰基保护的半乳糖胺为供体，以无水1,2‑二氯乙烷为溶剂，以三氟甲烷磺酸铜为催化剂，混合后加入受体，反应温度为110‑135℃，反应时间为6‑10h，得O‑糖链的前体类似物，经硅胶柱层析提纯，洗脱剂为乙酸乙酯和石油醚，展开剂为二氯甲烷和甲醇，提纯后再经细胞吸收，被细胞中酶利用，加工反应合成携带功能基团O‑糖链。该制备方法克服了传统化学法释放糖蛋白O‑糖链的缺陷，且还使糖链带上紫外基团，提高检测灵敏度，降低糖链极性，使糖链在色谱柱上保留，无需进行柱前衍生，便于糖链分离，既能用于糖链的微量分析又能用于糖链的制备，且得到的携带功能基团的O‑糖链还可用于后续糖芯片构建及功能分析。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种携带功能基团O-糖链的制备方法。

背景技术

O-糖链具有重要的生物学功能，如稳定蛋白质结构，参与细胞生长分化、细胞信号传递、介导病原菌感染等。但是，对于O-连接糖链，首先，O-糖基化没有保守的特征修饰序列用来预测糖基化位点；其次，已知O-连接糖链有8个核心结构，其结构变化与N-连接糖链相比更为复杂，合成无模板指导，且表达量低。最后，至今为止还未发现能将O-连接糖链整体从肽链上释放下来的通用内切酶，因此目前大多数研究人员都利用化学方法将O-连接糖链从肽段上释放下来，常用的化学法是碱性条件下的β-消除反应和肼解法。

肼解法可以用于释放N-连接糖链和O-连接糖链，但是因为该方法的反应条件比较剧烈，反应条件严苛，容易引起爆炸且肼是一种剧毒物质。因此，肼解法没有得到广泛应用。而β-消除反应是指糖蛋白在碱性环境下不稳定易发生β-消除造成糖肽键断裂从而使O-连接糖链从相应的糖蛋白上解离下来。但是非还原条件下糖链的半缩醛结构易发生peeling反应。为了阻止peeling反应，加入过量的还原剂将糖链的半缩醛结构还原为比较稳定的糖醇结构以保护糖链的还原性末端。因此，后续大多已发表的文献中均采用β-消除的方法进行O-连接糖链的释放，而且随着研究的不断发展其方法也在不断的改进和完善。

Rasilo等用硼烷氨络合物(NH3·BH3)代替了NaBH4，终止反应时不会产生大量的盐。Goetz等用28％的氨水溶解的硼烷氨络合物代替了NaOH和NaBH4，并对释放的糖链进行了甲基化修饰，虽然大大的提高了糖链的收率，但由于实验时间过长以及未能将糖链与肽段进行分离，还是造成了糖链的大量损失。非还原性释放及同时标记PMP：此方法由wang等2011年首先提出，基本原理是利用碱性环境对糖链进行解离，以及在碱性环境中对释放的糖链标记，以避免发生降解反应。它的最大优点是把释放和标记糖链结合了起来，简化了分析的步骤，避免了释放糖链过程中的副反应。但该法的样品需求量比较大，并且对酸性糖链的释放效率比较低。

由于O-糖链自身特性的原因，相对于N-糖链，O-糖链的研究还一直处于基础研究，对于O-糖链的功能研究甚少，因此，发展一种有效制备O-糖链的方法，同时实现对糖芯片构建以及后续功能分析具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种携带功能基团O-糖链的制备方法，该制备方法克服了传统化学法的缺陷、步骤简单、成本低廉，将其用于糖链的分析制备以及后续糖芯片构建等功能分析。

本发明提供的制备方法是基于寡糖代谢工程，先合成O-糖链的前体类似物，也就是O-糖基转移酶的抑制剂，再以细胞作为O-糖链合成的加工反应器，合成携带功能基团的O-糖链，该底物通过质谱以及核磁对其进行结构表征，糖链通过质谱对其进行分析。具体通过以下技术方案实现：

一种携带功能基团O-糖链的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：制备O-糖链的前体类似物：以全乙酰基保护的半乳糖胺为供体，以无水1,2-二氯乙烷为溶剂，以三氟甲烷磺酸铜为催化剂，混合后加入受体，反应温度为110-135℃，反应时间为6-10h，得O-糖链的前体类似物；