[发明专利]一种食源性益生菌胞内荧光标记方法及其体内应用

说明书

本发明涉及食源性益生菌的胞内荧光标记方法，包括以下步骤(a)通过DNA修饰长余辉纳米发光材料；(b)制备益生菌感受态；(c)将DNA包覆的纳米荧光探针电转至益生菌；(d)口服进入小鼠体内成像。本发明的有益效果在于：(1)本发明首次实现了发光纳米材料用于益生菌胞内荧光标记的方法，无需复杂的荧光材料表面功能化和抗体修饰，步骤简便，成本较低，相比于表面标记具有更好的稳定性和标记重现性。(2)本发明所开发的近红外荧光标记益生菌体内生物成像技术，可以借助菌体内部的长余辉纳米发光性质，实现原位无损的实时监控益生菌体在生物体内的代谢行为和分布状况，为食源性益生菌的功能位点及营养学提供了创新研究手段。

技术领域

本发明属于食源性益生菌的研究领域，涉及一种食源性益生菌胞内荧光标记方法及其体内应用。

背景技术

联合国粮农组织和世界卫生组织指出益生菌是一类活的微生物，当以一定数量摄入益生菌后，对宿主健康产生有益影响。研究表明，益生菌可抵御病原菌侵入，抑制病原菌繁殖，改善肠上皮细胞屏障功能、维持胃肠道内环境稳态，重建肠道菌群稳定。益生菌发挥益生作用主要通过产生优势菌群、生物夺氧和生物拮抗，且通过产生有益物质和抗菌物质(如有机酸、过氧化氢和细菌素等)来调节宿主机体免疫功能。研究表明通过益生菌来调节胃肠道菌群首先通过在胃肠道粘膜表面和表皮细胞的粘附和定植，这样阻止了病原菌在肠道中的定植和增长，常见的可作为益生菌的菌株有双歧杆菌(如长双歧杆菌、嗜热双歧杆菌)、乳酸菌(嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和罗伊氏乳杆菌)、芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌)、酵母菌(酿酒酵母)等。

传统的监测益生菌在动物胃肠道定植及饲喂益生菌在胃肠道存活情况的方法主要是通过采集粪便样品进行分析益生菌数量，或是通过在不同时间点宰杀实验动物，解剖动物胃肠道器官，对胃肠道部位内容物进行益生菌计数。然而粪便中益生菌的数量并不能真正反映该菌在动物胃肠道中的真正细菌增殖数，而且通过解剖动物的方法也不能动态监测整个动物体内胃肠道益生菌移动和数量的变化和发展。而且最重要的一点是，粪便中益生菌数量的检测无法辨别此菌是由动物饲喂摄入的还是来自于宿主本身胃肠道微生物定植的益生菌。而且对于益生菌发挥益生作用的机制还不清楚，摄入后在胃肠道中如何粘附和定植，其在体内的菌群数量变化规律是什么，是否增殖为优势菌群，在胃肠道各个不同肠段部位中的分布情况是什么，而且又对肠道内微生态产生怎么样的影响，随着时间的变化有着怎么样的规律，是否会在肠道内膜和上皮细胞上粘附和定植，是否进入小肠固有层和肠系膜淋巴结等，这些相关问题微生物学家一直以来在不断地探讨和研究，尚未得到解答。

随着现代分析技术的发展，光学成像已成为对活体进行实时监测的重要手段，生物发光作为光学成像的一种，该发光反应的本质是酶促反应，在一定条件下，荧光素酶催化荧光素反应，并发出可见光，发射光波可被高度敏感的电荷耦合CCD相机所检测在，该技术已被广泛应用于示踪干酪乳杆菌，植物乳杆菌，乳酸乳球菌等益生菌。荧光蛋白也是光学成像的一种，通过不同颜色的荧光蛋白标记益生菌达到示踪目的。但是这两种方法仍存在灵敏度低，发射波长短等问题，应用于体内成像有一定的局限性。

长余辉纳米发光材料(Persistent Luminescent Nanophosphors，PLNPs)是一种被高能激发(可见光、紫外光、X射线、γ射线、电子束等)后可产生可见或者近红外区域长时间发光的特殊纳米材料。相比于传统的纳米发光材料，PLNPs作为生物成像造影剂具备以下优点：(1)长余辉发光纳米材料毒性较低，表面修饰之后更适用于活体生物的体内研究；(2)长余辉纳米材料的光化学稳定性较好，可以避免光漂白现象的发生；(3)长余辉纳米材料可以体外激发进行光学成像，这样可以有效的避免生物体的自发光和激发光源的背景光对成像效果的影响；(4)长余辉纳米材料的发光可以通过改变合成条件和元素组成调控至近红外区域，能够增加检测光的生物组织穿透，提高光学成像的灵敏度。纵观所有潜在的荧光探针，只有近红外长余辉发光材料能够很好的满足现代光学生物成像的需要。因此，借助长余辉纳米探针对益生菌进行荧光标记，即可通过生物成像实现对益生菌在生物体内的代谢分布状况进行实时监控，为食品营养与健康研究开拓新的研究理念。

发明内容