[发明专利]一种检测恶性疟原虫k13基因四个抗性突变位点的方法

权利要求书

1.一种检测恶性疟原虫k13基因四个抗性突变位点的方法，其特征在于，该方法是基于GeXP系统实现恶性疟原虫k13基因四个抗性突变位点的检测；恶性疟原虫k13基因四个抗性突变位点分别为：Y493H、R539T、I543T以及C580Y；

GeXP系统将多重PCR技术和毛细管电泳技术相结合；

该方法具体包括以下步骤：

1)设计引物组

该引物组包括一对通用引物和针对恶性疟原虫k13基因四个抗性突变位点的四对特异性引物，四对特异性引物分别为：Y493H特异性引物、R539T特异性引物、I543T特异性引物以及C580Y特异性引物；

Y493H特异性引物是在Y493H的末端连接通用引物序列组成；R539T特异性引物是在R539T的末端连接通用引物序列组成；I543T特异性引物是在I543T的末端连接通用引物序列组成；C580Y特异性引物是在C580Y的末端连接通用引物序列组成；

2)提取恶性疟原虫的DNA

从人体的血液中提取恶性疟原虫的DNA，提取之前需先在人体的血液中加入RNA酶；且检测的人体血液中恶性疟原虫的浓度不低于5×10³copy/μL；

3)建立扩增体系

将步骤1)所述的四对特异性引物和采用荧光标记的通用引物相结合引发多重体系扩增，具体的为：将步骤1)所述的四对特异性引物、采用荧光标记的通用引物以及步骤2)中所提取的恶性疟原的DNA混合来建立扩增体系；

4)扩增产物分离

将步骤3)扩增后所得到的产物进行毛细管电泳技术分离，

5)确定突变基因的类型

将步骤4)中扩增完成后的含有荧光标记的PCR产物经GeXP检测窗口检测且计算出扩增片段的大小，将扩增片段的大小与质控品扩增后得到的扩增片段的大小相比较从而确定突变基因的类型。

2.根据权利要求1所述的一种检测恶性疟原虫k13基因四个抗性突变位点的方法，其特征在于，所述Y493H特异性引物的正向引物序列为：AGGTGACACTATAGAATATGGAAGTGCTGTATTGAATAATTTCTTACAC，

所述Y493H特异性引物的反向引物序列为：GTACGACTCACTATAGGGAATTTGACGTAACACCACAATTATTTCTTCTAG；

所述R539T特异性引物的正向引物序列为：AGGTGACACTATAGAATATAATTGTGGTGTTACGTCAAATGGTACA；

所述R539T特异性引物的反向引物序列为：GTACGACTCACTATAGGGATACATTCGGTATAATAGAAGAGCCATCATA；

所述I543T特异性引物的正向引物序列为：AGGTGACACTATAGAATATGGTGTTACGTCAAATGGTAGAATTTATTGTACT；

所述I543T特异性引物的反向引物序列为：GTACGACTCACTATAGGGACTCTCACCATTAGTTCCACCAATGAC；

所述C580Y特异性引物的正向引物序列为：AGGTGACACTATAGAATAATACCCCTAGATCATCAGCTATGTGT；

所述C580Y特异性引物的反向引物序列为：GTACGACTCACTATAGGGAATTATATAAGAATCTGACAATGTGGCAGCT。

3.根据权利要求1所述的一种检测恶性疟原虫k13基因四个抗性突变位点的方法，其特征在于，所述通用引物包括上游引物和下游引物，上游引物的引物序列为:AGGTGACACTATAGAATA，下游引物的引物序列为:GTACGACTCACTATAGGGA。

4.根据权利要求1-3任一项所述的一种检测恶性疟原虫k13基因四个抗性突变位点的方法，其特征在于，所述Y493H的特异扩增片段大小为200bp；所述R539T的特异扩增片段大小为113bp；所述I543T的特异扩增片段大小为232bp；所述C580Y的特异扩增片段大小为374bp。

5.根据权利要求4所述的一种检测恶性疟原虫k13基因四个抗性突变位点的方法，其特征在于，步骤4)中是依据检测片段与标准分子片段迁移时间计算出扩增片段的长度。