[发明专利]错配耐受的环介导等温扩增方法及应用

权利要求书

1.一种错配耐受的环介导恒温扩增方法，其特征在于，所述方法包括：以待测核酸样品为模板，以特异性扩增引物进行环介导等温扩增；其中DNA聚合酶应用高保真DNA聚合酶和链置换DNA聚合酶的混合酶。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：在一扩增体系中，以待测核酸样品为模板，以M种引物对进行扩增，当引物与模板存在错配时，高保真DNA聚合酶识别并切除引物3’端错配碱基；其中，M为≥1的正整数；

所述的M种引物对包括位点特异性引物对；包括：

第一引物对FIP和BIP：为内引物，用于构建LAMP反应的环结构；

第二引物对F3和B3：为外引物，用于置换内引物进而促进成环；

第三引物对FL和BL：为环引物，用于加速LAMP反应。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的高保真DNA聚合酶是具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶；较佳地，所述的高保真DNA聚合酶选自下组：Q5DNA聚合酶、SupertaqDNA聚合酶、HiFiTaq DNA聚合酶、KOD plus neo DNA聚合酶、Blend Taq DNA聚合酶、Promstar HS DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、KOD FX DNA聚合酶或其组合。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的链置换DNA聚合酶是不具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶；较佳地，所述的链置换DNA聚合酶选自下组：大片段Bst DNA聚合酶、全长Bst DNA聚合酶、Bst 2.0DNA聚合酶、Bst 3.0DNA聚合酶、Bst 2.0DNA聚合酶、或其组合。

5.如权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述的高保真DNA聚合酶的量为0.002～0.026U每微升反应体积；较佳的为0.004～0.018U每微升反应体积；更佳的为0.006～0.016U每微升反应体积。

6.如权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述的链置换DNA聚合酶的量为0.08～0.48U每微升反应体积；较佳的为0.16～0.4U每微升反应体积；更佳的为0.24～0.32U每微升反应体积。

7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的高保真DNA聚合酶与链置换DNA聚合酶的比例按照酶活性单位比例为1:10～1:160；较佳地1:15～1:80；更佳地1:20～1:60。

8.如权利要求1或2所述的方法，所述环介导等温扩增的反应温度为50～70℃；较佳的为58～68℃；更佳的为62～65℃；和/或

所述环介导等温扩增的反应时间为10～120分钟；较佳的为30～90分钟；更佳的为45～60分钟；和/或

所述环介导等温扩增的仪器包括选自下组的仪器：温控水浴锅，金属浴锅，PCR仪，荧光定量PCR仪，荧光恒温扩增仪。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过荧光法、比色法或浊度法进行扩增产物的分析和检测；较佳地，加入双链DNA结合荧光染料或者酸碱及离子显色染料，从而实现结果的荧光实时检测，或紫外光下的荧光显色或常见光下的比色反应。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述双链DNA结合染料包括选自下组的染料：SYBR Green I，SYTO 9；和/或

所述酸碱指示染料包括选自下组的染料：钙黄绿素，羟基萘酚蓝，中性红，甲酚红，甲酚紫，苯酚红。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待测样品是含有病原体核酸的样品，较佳地是含有高变异性病原体核酸的样品，所述的高变异性病原体如病毒。