[发明专利]治疗性的人Plk1蛋白单克隆抗体及其制备方法

权利要求书

1.治疗性的人Plk1蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，利用PCR技术体外扩增Plk1基因，Plk1基因的核酸序列为SEQ ID NO.1所示；

S2，Plk1基因的表达和纯化：将Plk1基因连接进入pET-28a载体中，并将质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导后收集菌体；高压破碎菌体，离心后收集上清，利用Ni柱亲和层析纯化蛋白；纯化后的蛋白利用Superdex-200柱子进行再次精细纯化，收集Plk1蛋白作为抗原备用，Plk1蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示；

S3，小鼠的免疫：用纯化的Plk1蛋白作为抗原，对6-8周龄的雌性BALB/c小鼠3只进行三次免疫，每次免疫间隔两周，第三次免疫后10天，尾部采血，并用间接ELISA检测小鼠产生的抗体滴度；在融合前的第3天尾静脉最后一次注射重组抗原，剂量为60ug/只，进行加强免疫一次；

S4，骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合：分别收集免疫小鼠脾细胞和SP2/0细胞，DMEM培养基洗涤3次后，调整脾细胞数与SP2/0细胞数之比为1∶10，50％PEG1500作用1～2min后，加入含有HAT的完全培养基稀释，接种于96孔培养板，37℃，5％CO₂培养；

S5，阳性杂交瘤细胞筛选与克隆化：经间接ELISA方法连续检测两次都为阳性的细胞孔，按有限稀释法进行亚克隆；如检出细胞孔有特异性抗Plk1蛋白抗体，可选择抗体效价高，呈单个克隆生长，形态良好的杂交瘤细胞孔，继续同法再克隆至少2次，克隆后阳性孔的杂交瘤细胞可移至24孔培养板，待24孔板中的杂交瘤细胞生长良好时，可冻存杂交瘤细胞；

S6，单克隆抗体的生产：对已经建株的杂交瘤细胞扩大培养同时在BALB/c小鼠体内诱生小鼠腹水生产单克隆抗体；

S7，单克隆抗体的纯化：腹水用20mM PBS pH7.4稀释3倍以上，离心取上清，经HiTrapprotein G亲和层析进行纯化，获得治疗性的人Plk1蛋白单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的治疗性的人Plk1蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，S3的免疫方案具体为：

第一阶段，小鼠选取：选取6-8周龄，健康活跃小鼠3只，编号；

第二阶段，抗原乳化：每只小鼠60ug，抗原+1×PBS总体积为350ul，与等体积福氏佐剂混合乳化3500次，200次/min，获得每0.2ml含60ug抗原的乳化液；

第三阶段，第一次免疫：用2ml注射器每只小鼠腹股沟皮下注射0.2ml乳化液，并记录注射时间和部位；

第四阶段，第二次免疫：间隔两周，用2ml注射器每只小鼠腹腔注射0.2ml乳化液，并记录注射时间和部位；

第五阶段，第三次免疫：间隔两周，用2ml注射器每只小鼠腹股沟皮下注射注射0.2ml乳化液，并记录注射时间和部位；

第六阶段，测效价：间隔10±1天后取血检测进行Elisa检测。

3.根据权利要求1所述的治疗性的人Plk1蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，S4的亚克隆方案具体为：克隆前一天制备小鼠饲养细胞层；将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻地吹下，用血细胞计数板计数活细胞数；将细胞用完全培养基稀释到每毫升5、10、50个细胞；将上述三个浓度的细胞悬液分别加入已制备好的饲养细胞的96孔培养板中100μL/孔，使相应的每孔分别含0.5、1和5个细胞；培养第4天半量换液一次，第5-6天仔细观察各孔内细胞的生长情况，并记录；在克隆后第10-14天，细胞长满约1/4-1/2孔底时，进行全量换液，次日进行间接ELISA检测。

4.根据权利要求1所述的治疗性的人Plk1蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，S6的诱生小鼠腹水生产单克隆抗体方案具体为：取10周龄的BALB/c小鼠，腹腔注射液体石蜡0.5mL/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5×10⁵-1×10⁶/只，7-10天后抽取小鼠腹水。