[发明专利]一种鼻咽癌类器官的培养与鉴定方法

权利要求书

1.一种鼻咽癌类器官的培养基，其特征在于，上述培养基包括以下组分：B27、N-acetylcysteine、EGF、Noggin、R-spondin 1、A83-01、HGF、Nicotinamide、Y-27632、Wnt3a、Glutmax、Heregulinβ-1、Gastrin、FGF-10、Prostaglandin E2、SB202190和FGF-7；各组分的含量为：B27，50X稀释；N-acetylcysteine 1mM；EGF 5ng/ml；Noggin 100ng/ml、R-spondin1 250ng/ml；A83-01 500nM；HGF10ng/ml；Nicotinamide 10mM；Y-27632 10μM；Wnt3a250ng/ml；Glutmax 100X稀释；Heregulinβ-1 20ng/ml；Gastrin 1nM；FGF-10 10ng/ml；Prostaglandin E2 1μM；SB202190 10μM；FGF-7 10ng/ml。

2.一种鼻咽癌类器官的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：将肿瘤组织在冰上剪碎，加入类器官消化酶I重悬，转移恒温摇床消化；第一次消化结束后，离心弃上清，加消化酶II吹打重悬，将离心管放入恒温摇床消化，加入Hanks液终止消化，经消化酶II消化后为单细胞；第二次消化结束后，离心弃上清，获得细胞沉淀，再加Hanks液吹打重悬消化的组织沉淀；用细胞筛网过滤细胞，离心弃上清；取红细胞裂解液重悬细胞后加入HBSS终止；再进行细胞计数，离心得鼻咽癌单细胞沉淀；全程低温冰上操作，加入计算量的预冷DMEM/F12培养基，再混合matrigel，将胶滴接种至培养皿中；将培养皿静置，观察胶滴是否流动，若不流动，放入恒温孵箱，倒置；加入权利要求1的鼻咽癌类器官培养基；定期更换培养基，培养出鼻咽癌类器官。

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：将肿瘤组织在冰上剪碎，加入类器官消化酶I重悬，转移至37℃、220rpm恒温摇床消化1.5小时左右；第一次消化结束后，离心弃上清，加2ml消化酶II吹打重悬，将离心管放入37℃、220rpm恒温摇床消化10min，加入Hanks液终止消化，经消化酶II消化后为单细胞；第二次消化结束后，离心弃上清，获得细胞沉淀，再加2ml Hanks液吹打重悬消化的组织沉淀；用70μm细胞筛网过滤细胞，离心弃上清；取1ml红细胞裂解液重悬细胞2-3min后加入1ml HBSS终止；再进行细胞计数，离心得鼻咽癌单细胞沉淀；全程低温冰上操作，加入计算量的预冷DMEM/F12培养基，再混合matrigel，3000细胞每50μl胶滴混合液，用100μl移液枪将胶滴接种至6cm培养皿中，每个胶滴大小约30μl；将培养皿静置2min，观察胶滴是否流动，若不流动，放入37℃，5％CO2恒温孵箱，倒置45min；加入权利要求1的鼻咽癌类器官培养基，约2ml；每间隔2-3天更换一次培养基，培养出鼻咽癌类器官。

4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，胶滴混合液中，DMEM/F12培养基与matrigel的比例为1:2；和/或，消化酶I为collagenase type II和分散酶；和/或，消化酶II为TrypLE Express和DNaseI酶。

5.一种权利要求2-4任一项培养的鼻咽癌类器官的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)鼻咽癌组织做肿瘤全外显子测序，患者血液做EBV全基因测序；(2)类器官培养成功第一代并传代后，分别将类器官第一代、第三代、第五代、第七代、第九代做肿瘤全外显子和EBV全基因测序；(3)若患者病理诊断结果为非角化未分化鼻咽癌，则第一代类器官做HE染色证实其为肿瘤细胞；若患者病理诊断结果为分化的鼻咽癌，则需HE染色及免疫组化检测上皮标志物角蛋白的表达；(4)判断类器官第一代肿瘤全外显子测序结果与患者肿瘤组织测序结果比较是否一致、患者血液中EBV测序和类器官EBV测序结果是否一致；上述两种测序比较结果一致时，则证明该类器官是该患者来源的鼻咽癌肿瘤细胞；(5)类器官第一、三、五、七、九测序结果比对，观察基因突变是否一致，以鉴定类器官遗传的稳定性。