[发明专利]一种基于温敏水凝胶材料的非胰酶消化收获细胞培养方法

说明书

本发明公开了一种基于温敏水凝胶材料的非胰酶消化收获细胞培养方法。首先通过乳液聚合法制得水凝胶溶液，该水凝胶在低温下能保持溶液状态，在接近人体生理温度之后能迅速形成水凝胶。基于该温敏水凝胶材料，本发明通过以下两种方案实现细胞的非酶收获：1)将细胞悬液和水凝胶溶液混合后置于37℃细胞培养箱，混合液迅速形成凝胶后加入37℃的培养基进行培养，之后通过降温释放细胞；2)将水凝胶溶液先涂在基底表面，置于37℃细胞培养箱中，待形成凝胶后将37℃的细胞悬液和培养基加入进行培养，之后通过降温释放细胞。本发明的细胞培养方法无需胰酶消化，无需细胞刮刀，能更好的保存细胞表面蛋白及标记，保证细胞高活力，是一种无损细胞培养方法。

技术领域

本发明涉及一种无需胰酶消化和刮刀的细胞收获方法，尤其涉及一种基于温敏水凝胶材料的无胰酶消化收获细胞培养方法。

背景技术

壳聚糖是源于自然界的氨基多糖，其大分子链由乙酰氨基葡萄糖和脱乙酰氨基葡萄糖通过无规或者嵌段分布组成，具有良好的生物相容性、血液相容性、止血性能、抗菌性能以及天然的药物活性，对伤口的愈合有促进作用，在生物体内可被溶菌酶降解，最终降解产物为氨基葡萄糖，呈弱碱性，与体液的pH值吻合，可被机体吸收，在生物和医学领域具有巨大的应用潜能。

在对壳聚糖资源的开发利用中，水凝胶是一种重要的形式。水凝胶材料具有多种优良特性，其应用遍布日常生活以及先进工业的各个方面。与传统水凝胶相比，智能水凝胶因其能对外界环境的细微变化产生响应而受到广泛关注。其中，对外界温度刺激产生响应的水凝胶，被称为温度敏感水凝胶，也称作温敏水凝胶。温敏水凝胶中含有一定比例的亲水基团和疏水基团，温度的变化可以影响疏水基团之间的相互作用，从而使凝胶的网络结构改变，导致水凝胶发生相转变。温敏壳聚糖水凝胶具备高吸水性、保水性、良好的生物相容性及温度敏感特性，在生化分离、细胞培养、药物控制释放系统等生物材料和医用材料领域具有广泛的应用前景。

种子细胞的体外培养对组织工程、细胞治疗等再生医学领域有着重要的意义。目前，在传统的2D平面和3D支架等细胞培养方法中，胰酶消化、细胞刮刀是广泛使用的细胞收获方法。然而，这类方法会导致细胞膜蛋白的损伤，进而导致细胞膜的破坏、细胞表面标记的缺失或者细胞功能的部分损失，这将消弱种子细胞在再生医学领域的应用价值。温敏壳聚糖水凝胶材料的研发为解决上述问题提供了新思路。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于温敏水凝胶材料的非胰酶消化收获细胞培养方法。

本发明所述的一种具有温度敏感特性的壳聚糖水凝胶的制备方法是：

1)按重量计，将1-20份壳聚糖、0.1-2份酸、0.01-8份引发剂、1-20份N-异丙基丙烯酰胺单体、50-98份去离子水加入反应器中，搅拌溶解均匀后，在40-90℃反应1-12小时，然后使用去离子水将反应产物透析至中性，真空冻干得到聚N-异丙基丙烯酰胺改性壳聚糖粉末。

2)将1-20份1)中的聚N-异丙基丙烯酰胺改性壳聚糖粉末加入80-99份PBS溶液中，搅拌溶解均匀后得到聚N-异丙基丙烯酰胺改性壳聚糖溶液，简称水凝胶溶液。

所述的壳聚糖分子量为3万-150万，脱乙酰度为50％-98％。

所述的酸为盐酸、丙烯酸、柠檬酸、乙酸中的至少一种。

所述的引发剂为偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈、偶氮二异丁酸二甲酯、偶氮二异丁基脒盐酸盐、过氧化氢、过硫酸铵、过硫酸钾、叔丁基过氧化氢中的至少一种。

所述的聚N-异丙基丙烯酰胺改性壳聚糖大分子具有良好的水溶性。所述的温敏壳聚糖水凝胶在接近人体生理温度时能迅速(5秒到60分钟内)形成水凝胶，在室温下能保持溶液状态。

本发明所述的一种基于温敏水凝胶材料的无胰酶消化收获细胞培养方法，其培养方案包含以下两种：