[发明专利]重组细胞及制备方法、外源基因定点整合到CHO细胞基因组的方法及试剂盒、重组细胞株

权利要求书

1.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞的保藏号为CCTCC NO：C2018241。

2.一种重组细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将靶向片段和荧光蛋白基因整合到CHO细胞基因组上，筛选荧光强度不低于预设值的单克隆细胞，得到重组细胞，所述靶向片段的序列如SEQ ID No.1所示，所述将所述靶向片段和荧光蛋白基因整合到所述CHO细胞基因组，筛选荧光强度不低于预设值的单克隆细胞，得到所述重组细胞的步骤包括：

采用序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的第一扩增引物对扩增SV40启动子，得到第一PCR产物；

采用序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的第二扩增引物对扩增荧光蛋白基因，得到第二PCR产物；

采用序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的第三扩增引物对扩增Zeocin抗性基因，得到第三PCR产物；

将所述第一PCR产物、所述第二PCR产物及所述第三PCR产物转入线性化载体中，得到重组载体，所述线性化载体为线性化的pcDNA3.4质粒载体；及

采用所述重组载体转染所述CHO细胞中，依次经Zeocin抗性筛选和荧光强度筛选，得到所述重组细胞。

3.根据权利要求2所述的重组细胞的制备方法，其特征在于，所述重组质粒插入到所述CHO细胞的NCBI登录号为NW_003614849的序列上。

4.一种外源基因定点整合到CHO细胞基因组的方法，其特征在于，包括如下步骤：

构建含有靶向片段的供体质粒，且所述供体质粒的多克隆位点上插入有外源基因，所述靶向片段的序列如SEQ ID No.1所示；及

将所述供体质粒、能够表达Cas9核酸酶的质粒和能够表达向导RNA的质粒共转染权利要求2～3任一项所述的重组细胞的制备方法制备的重组细胞，以使所述外源基因定点整合到所述CHO细胞基因组上。

5.根据权利要求4所述的外源基因定点整合到CHO细胞基因组的方法，其特征在于，所述能够表达Cas9核酸酶的质粒含有NLS-SpCas9-NLS基因，所述NLS-SpCas9-NLS基因的序列如SEQ ID No.2所示。

6.根据权利要求4所述的外源基因定点整合到CHO细胞基因组的方法，其特征在于，所述构建含有所述靶向片段的供体质粒的步骤包括：

采用序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的第四扩增引物对扩增polyA，得到第四PCR产物；

采用序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的第五扩增引物对扩增EM7基因，得到第五PCR产物；

采用序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的第六扩增引物对扩增潮霉素抗性基因，得到第六PCR产物；及

将所述第四PCR产物、所述第五PCR产物及所述第六PCR产物转入线性化质粒中，将所述外源基因插入所述线性化质粒的多克隆位点，得到所述供体质粒。

7.根据权利要求6所述的外源基因定点整合到CHO细胞基因组的方法，其特征在于，在将所述供体质粒、能够表达Cas9核酸酶的质粒和能够表达向导RNA的质粒共转染所述重组细胞的步骤之前，还包括构建所述能够表达向导RNA的质粒的步骤：

将如SEQ ID No.15所示的第一正向引物和如SEQ ID No.16所示的第一反向引物混合退火后转入骨架质粒中，得到所述能够表达向导RNA的质粒。

8.一种外源基因定点整合到CHO细胞基因组的试剂盒，其特征在于，包括：

权利要求2～3任一项所述的重组细胞；

供体质粒，所述供体质粒含有靶向片段和供外源基因插入的多克隆位点，所述供体质粒中的靶向片段的序列与所述重组细胞中的靶向片段的序列相同；

含有NLS-SpCas9-NLS基因的能够表达Cas9核酸酶的质粒；及

表达向导RNA的质粒。

9.一种重组细胞株，其特征在于，所述重组细胞株的保藏号为CCTCC NO：C2018257。