[发明专利]一种带绿茎标记的番茄核雄性不育系的创建方法

权利要求书

1.一种带绿茎标记的番茄核雄性不育系的创建方法，其特征在于，所述方法包括：利用CRISPR/Cas9系统对受体番茄基因组中的育性基因SlMs10³⁵及其连锁的标记基因SlF3H同时进行编辑，使所述育性基因SlMs10³⁵和所述标记基因SlF3H丧失功能，得到的所述SlMs10³⁵和所述SlF3H同时丧失功能的番茄即为所述带绿茎标记的番茄核雄性不育系；其中，所述标记基因SlF3H为花青素合成基因。

2.如权利要求1所述的一种带绿茎标记的番茄核雄性不育系的创建方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统中包含2个sgRNA，分别为sgRNA-SlMs10³⁵和sgRNA-SlF3H；其中，所述sgRNA-SlMs10³⁵和所述sgRNA-SlF3H识别的靶序列分别依次为所述受体番茄基因组中编码SlMs10³⁵和SlF3H蛋白的DNA片段。

3.如权利要求1所述的一种带绿茎标记的番茄核雄性不育系的创建方法，其特征在于，所述SlMs10³⁵蛋白和所述SlF3H蛋白为a1或a2；

a1：所述SlMs10³⁵和所述SlF3H氨基酸序列分别是SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所表示的蛋白质；

a2：将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或多个氨基酸残基得到的由a1衍生的蛋白质。

4.如权利要求1所述的一种带绿茎标记的番茄核雄性不育系的创建方法，其特征在于，所述SlMs10³⁵的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，所述SlF3H的核苷酸序列为SEQ ID NO.4；

其中，SEQ ID NO.3为SlMs10³⁵基因在番茄基因组中的序列，共由3302个核苷酸组成，其中1-2000位为启动子区域，第2001-2201位、第2299-2475位、第2573-2749位和第2928-3002位为外显子，第2202-2298位、第2476-2572位和2750-2927位为内含子，第3003-3302位为终止子；SEQ ID NO.4为SlF3H基因在番茄基因组中的序列，共由4365个核苷酸组成，其中1-2000位为启动子区域，第2001-2407位、第3026-3454位和第3523-4064位为外显子，第2408-3025位和第3455-3522位为内含子，第4065-4364位为终止子。

5.如权利要求2所述的一种带绿茎标记的番茄核雄性不育系的创建方法，其特征在于，所述sgRNA-SlMs10³⁵识别的靶序列位于所述SlMs10³⁵蛋白的编码基因中的任意位置；所述sgRNA-SlF3H识别的靶序列位于所述SlF3H蛋白的编码基因中的任意位置，只要能够使核酸酶特异性切割靶序列从而使番茄丧失产生有功能的所述SlMs10³⁵和SlF3H蛋白的能力即可。

6.如权利要求5所述的一种带绿茎标记的番茄核雄性不育系的创建方法，其特征在于，所述核酸酶为Cas9蛋白，所述靶序列为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示DNA分子序列中符合5’-N₂₀-NGG-3’或5’-CCN-N₂₀-3’序列排列规则的片段；N表示A、G、C和T中的任一种；所述SlMs10³⁵和SlF3H的靶序列依次为序列表中的SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。

7.如权利要求1所述的一种带绿茎标记的番茄核雄性不育系的创建方法，其特征在于，所述核雄性不育系的表型为幼苗期下胚轴呈现绿色且其植株不能产生花粉。